Спектральні властивості та характеристики хромофорів. Діаграма Яблонської

Електронна спектроскопія

у супрамолекулярній хімії

Основні розділи:

Фізичні основи поглинання світла та фотолюмінесценції

Техніка вимірювання електронних спектрів поглинання та люмінесценції

Сучасні методи обробки спектроскопічних даних

Приклади застосування електронної спектроскопіїдля дослідження властивостей супрамолекулярних систем

Експериментальні методи хімії високих енергій: Навчальний посібник/За заг. ред. М. Я. Мельникова. - М.: Вид-во МДУ, 2009. - 824 с

(ISBN 978-5-211-05561-2).

О.М. Ушаков / Самозбір і фотохімія супрамолекулярних систем на основі крауновмісних ненасичених сполук // дис. док. хім. наук, ІПГФ РАН, Чорноголівка, 2006. - 263 с.

[email protected] )

Додаткова література:

E.N. Ушаков et al, Sandwich-type complexes alkaline-earth metal cations з bisstyryl dye містить два коронних інших units, J. Phys. Chem. A, 1999, vol. 103, p. 11188-11193.

(є в електронному вигляді, PDF-файл, [email protected] )

I. Фізичні основи поглинання світла та фотолюмінесценції

Взаємодія світла з речовиною

Світло, як відомо, характеризується довжиною хвилі  та частотою  які пов'язані співвідношенням

де з - швидкість світла у вакуумі, n - Показник заломлення середовища.

Хвильову теорію світла використовують із інтерпретації таких явищ як відбиток, заломлення, дифракція світла, тобто. явищ, у яких світло не поглинається середовищем.

Однак для опису поглинання та випромінювання світла речовиною необхідно використовувати квантову теорію, згідно з якою світлова енергія може поглинатися лише певними порціями або квантами. Енергія , переносима одним квантом світла, або, іншими словами, фотоном, визначається рівнянням Планка:

де h - Постійна Планка. Тобто монохроматичне світло характеризується не тільки довжиною хвилі, але також і енергією фотона.

Поглинання монохроматичного світла гомогенним середовищем, що містить речовину, що поглинає світло, підпорядковується закону Ламберта-Бера:

де I 0 - Енергія монохроматичного світла, що падає за одиницю часу на поверхню шару речовини; I - Енергія, що пройшла через шар речовини за одиницю часу; l - Товщина шару, см; C - Концентрація поглинає світло речовини, моль / л;  – молярний коефіцієнт поглинання (екстинкція), л/(мольсм), який залежить від природи речовини, довжини хвилі світла та температури.

У фотохімії для характеристики поглинання зазвичай використовують поняття оптична щільність розчину ( D , безрозмірна величина)

Закон Ламберта-Бера не виконується у тих випадках, коли значна частка молекул переходить у збуджений стан (наприклад, при дуже високій інтенсивності падаючого світла). Відхилення від закону Ламберта-Бера іноді спостерігаються і за низьких інтенсивностей світла. Однак ці відхилення є уявними; як правило, вони пов'язані або з недостатньою роздільною здатністю спектрометра, або з такими явищами як асоціація молекул.

Порушені електронні стани

Використовуючи слово «світло», ми зазвичай маємо на увазі оптичне випромінювання, видиме людським оком. Спектральна крива чутливості людського ока лежить в діапазоні 400 £ l £ 750 нм. Максимум чутливості становить близько 555 нм (зелене світло). Для фотохімії інтерес представляє ширша область випромінювання, яку формально можна розділити так:

ближнє ультрафіолетове (200 £ l£ 400 нм)

видиме (400£ l£ 750 нм)

ближнє інфрачервоне випромінювання (750£ l£ 1000 нм)

При поглинанні кванта світла з l = 200-1000 нм збуджуються зовнішні електрони молекули, що здійснюють хімічний зв'язок; їхнє збудження може призводити до хімічного перетворення. Цей спектральний діапазон є основним для спектроскопії поглинання та випромінювання світла.

Спектри поглинання

Спектр поглинання речовини зазвичай складається зі смуг різної інтенсивності та ширини. Походження цих смуг можна проілюструвати за допомогою енергетичної діаграми молекулярних орбіталей (МО). Електрони в молекулі здебільшого розташовуються парами на МО з різною енергією. Довгохвильова смуга в електронному спектрі поглинання зазвичай відповідає переходу електрона з верхньої зайнятої МО (ВЗМО) на нижню вакантну МО (НВМО). Смуги поглинання з більшою енергією відповідають переходам на вищележачі вакантні МО (наприклад, S 0 S 2) або переходам з зайнятих МО нижче (наприклад, S –1 S 1).

Структура та форма смуги поглинання

Смуги у спектрах поглинання нерідко мають певну структуру. Це з тим, що кожному електронному стану відповідає набір різних коливальних станів. На малюнку показано залежність потенційної енергії двоатомної молекули в основному електронному стані від міжядерної відстані (крива S 0 ). Максимуми на кривих для коливальних станів (  = 0, 1, 2, 3, 4) відповідають найімовірнішим міжядерним відстаням. Для нульового коливального стану  = 0 найімовірніша між'ядерна відстань знаходиться в області мінімуму кривої потенційної енергії. Для більш високих коливальних рівнів найімовірніші між'ядерні відстані знаходяться поблизу точки повороту коливання.
Принцип Франка Кондона Для пояснення відносної інтенсивності переходів між коливальними рівнями основного та збудженого електронних станів використовують принцип Франка Кондона. Цей принцип заснований на тому, що електронний перехід є набагато швидшим процесом (~10  15 с), ніж рух ядер у молекулі (~10  13 с), тобто за час електронного переходу взаємне розташування ядер та їх імпульси практично не змінюються . Тому електронно-коливальні переходи можна представити вертикальними лініями, що з'єднують поверхні потенційної енергії основного. S 0 та збудженого S 1 електронні стани. Більшість молекул за кімнатної температури перебуває на нульовому коливальному рівні, тому фотоіндуковані електронні переходи відбуваються саме з цього рівня. При даному розташуванні потенційних кривих S 0 і S 1 найімовірнішим електронно-коливальним переходом буде ( 0  2 )-перехід. Інтенсивність ( 0  0 )-переходу порівняно мала, оскільки цьому переходу відповідає малоймовірна міжядерна відстань.

У багатоатомній молекулі крива потенційної енергії перетворюється на багатовимірну поверхню, тому одному електронному переходу відповідає безліч коливальних переходів. Часто ці коливальні переходи близькі за енергією і відповідає одна загальна широка смуга поглинання. Форма цієї лінії, проте, визначається принципом Франка-Кондона.

Процеси релаксації у електронно-збуджених станах.

У рідких розчинах при кімнатній температурі електронно-збуджені стани молекул піддаються порівняно швидким процесам релаксації електронно-коливальної енергії. Основні процеси релаксації: внутрішня конверсіяіз верхніх збуджених станів S n у нижній збуджений стан S 1 (< 10  12 с) и коливальна релаксаціяв стані S 1 , тобто. дисипація надлишкової енергії коливань у середовищі за рахунок зіткнень збуджених молекул речовини з молекулами середовища (~10-11 с).

Ці процеси, зазвичай, відбуваються значно швидше проти процесом спонтанного випромінювання фотона, тобто. випромінювальною дезактивацією збудженого стану S 1 (~10 - 9 с). Тому випромінювальний перехід із стану S 1 в основний стан S 0 званий флуоресценцією , Походить, як правило, з нульового коливального стану. Таким чином, загальним переходом при поглинанні та випромінюванні світла є перехід між нульовими коливальними рівнями основного та збудженого станів, який називають ( 0  0 )-переходом. Енергія ( 0  0 )-переходу - найменша при поглинанні та найбільша при випромінюванні. Стану S 0 і S 1 зазвичай мають аналогічні розподіли коливальних рівнів за енергіями, тому спектр флуоресценції, як правило, близький до дзеркального відображенняспектра поглинання, якщо обидва спектри представлені шкалою енергії фотона.

Стокс зрушення

Для складних молекул у рідкій фазі ( 0  0 )-перехід у спектрі флуоресценції має меншу енергію, ніж ( 0  0 )-перехід у спектрі поглинання. Це з тим, що відразу після поглинання чи випромінювання фотона молекула перебувають у нерівноважному стані сольватації. У нев'язких розчинниках при кімнатній температурі перехід збудженого флуорофора в рівноважний стан сольватації відбувається до випромінювання фотона. Тому ( 0  0 )-перехід при випромінюванні світла має меншу частоту, ніж ( 0  0 )-перехід при поглинанні. Зміщення смуги флуоресценції в червону область щодо довгохвильової смуги поглинання називається стоксовим зрушенням.

Мультиплетність

Мультиплетність електронного стану дорівнює n+ 1, де n- Число неспарених електронів. Молекулярні орбіталі молекул із парним числом електронів заповнені парами електронів із протилежно спрямованими спинами. Мультиплетность основного стану більшості молекул із парним числом електронів дорівнює 1, тобто. це синглетні стани. При переході електрона на верхню орбіталь його спин може виявитися орієнтованим в тому ж або в протилежному напрямку щодо електрона, що залишився на нижній орбіталі. Якщо орієнтації спина зберігається, мультиплетність збудженого стану, як і основного стану, буде синглетним. Якщо ж електрон, що збуджується, змінює напрямок спина, збуджений стан буде триплетним. Таким чином, одному основному стану відповідають різні збуджені стани – синглетні та триплетні.

Діаграма Яблонської

Фізичні процеси, які у електронно-збудженому стані молекул, прийнято представляти як діаграми Яблонського. Основними безвипромінювальними процесами дезактивації нижнього збудженого стану S 1 є внутрішня конверсія (перехід між станами однакової мультиплетності) та інтеркомбінаційна конверсія (перехід між станами різної мультиплетності, наприклад, синглет-триплетний перехід S 1  T 1 ). Внутрішня конверсія S 1 S 0 - Порівняно повільний процес. Тому у збудженому стані S 1 можуть спостерігатися процеси спонтанного випромінювання фотона (спонтанне випромінювання) та фотохімічні реакції. Випромінювальними процесами є дозволена по спину флуоресценція та заборонена по спину фосфоресценція.

Класифікація електронних переходів

Електронні спектри поглинання в УФ та видимому діапазонах, дають важливу інформацію про структуру та властивості електронно-збуджених станів молекул. Знання спектра поглинання речовини є обов'язковою умовою фотолюмінесцентних та фотохімічних досліджень. Коротко зупинимося на класифікації електронних переходів

Електрони в органічній молекулі розташовуються на молекулярних -, - та n-орбіталях. На кожній молекулярній орбіталі містяться два електрони, що відрізняються спинами. При збудженні молекули світлом відбувається перехід електрона із зайнятої зв'язувальної орбіталі на вільну орбіталь, що розпушує. Такі переходи позначають відповідно до їх орбітальної природи: *, n*, * та n*.

Смуги поглинання, зумовлені переходами * , знаходяться переважно у вакуумній УФ області< 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.

Переходамn  * відповідають смуги поглинання УФ області. Наприклад, органічні сполуки, що містять n-Електрони, локалізовані на орбіталяхгетероатомів, О, N, S, поглинають УФ світло в області близько 200 нм.

Пєреходам * і n  * відповідають смуги поглинання у середній УФ-області. При поєднанні кратних зв'язків смуги, обумовлені цими переходами, зміщуються в ближню УФ і видиму область спектра. Переходи n* характерні для сполук, що містять такі хромофорні групи, як С=О, C=S, N=N; ці переходи часто виявляються забороненими, і відповідні смуги поглинання мають порівняно низьку інтенсивність.

Ця класифікація придатна переважно щодо простих молекул. У складних молекулах певний внесок у електронний перехід можуть робити електрони, що знаходяться на орбіталях різного типу.

Значний інтерес становлять електронні переходи із перенесенням заряду.Якщо в молекулі є електронодонорна та акцепторна групи, і вони знаходяться в -електронному сполученні, то перехід S 0 S 1 може супроводжуватися перенесенням заряду від донора до акцептора по ланцюгу сполучення, як, наприклад, в даному стириловому барвнику:

У цьому випадку говорять про електронний перехід з внутрішнім перенесенням заряду. Відповідні смуги поглинання зазвичай характеризуються високою інтенсивністю та розташовуються у видимій, а іноді й у ближній ІЧ області.

Для слабозв'язаних органічних донорно-акцепторних комплексів можуть спостерігатися смуги поглинання, що належать до електронного переходу з перенесенням заряду від донора до акцептора через простір ( міжмолекулярне перенесення заряду). Такі комплекси часто називають комплексами із перенесенням заряду. Довгохвильові смуги поглинання таких комплексів мають порівняно низьку інтенсивність і можуть перебувати в ближній УФ, видимій та ближній ІЧ області спектра.

У металорганічної хімії розрізняють смуги поглинання, відповідні перенесення заряду від ліганду до металу ( ПЗЛМ) та від металу до ліганду ( ПЗМЛ).

Люмінесценція - світіння атомів, іонів, молекул, що виникає в результаті електронного переходу в цих частках при їх поверненні зі збудженого стану до нормального. Таким чином молекула перетворює поглинену енергію у власне випромінювання (В. Л. Льовшин). Люмінесценцію називають холодним світінням.

Класифікація видів люмінесценції 1. За тривалістю свічення 2. За способом збудження 3. За механізмом свічення: свічення дискретних центрів – поглинаючими та випромінюючими центрами є одні й ті ж частинки (атоми, молекули, іони) рекомбінаційне свічення – процеси поглинання та у просторі; у процесі збудження відбувається поділ частинки речовини на дві протилежно заряджені частини; подальша їх рекомбінація супроводжується виділенням енергії А + hv A + + e A + + e A * A * A + hv 3

Класифікація люмінесценції за тривалістю світіння флуоресценція (~10 -8 c) При флуоресценції молекула переходить в основний стан з короткоживучого збудженого стану Вона спостерігається відразу ж після поглинання світла, швидко спадає і зникає в результаті зіткнень випромінюючої молекули з іншими молекулами в розчині фосфоресценція (>10 -6 с) Фосфоресценція спостерігається при переході молекули в основний стан відносно довгоживучого збудженого стану, так що між поглинанням і випромінюванням світла може пройти відносно багато часу Для фосфоресценції характерні більша довжина хвилі випромінювання, менша інтенсивність і більший вплив матриці 4 10 -6 с) Фосфоресценція спостерігається при переході молекули в основний стан відносно довгоживучого збудженого стану, так що між поглинанням і випромінюванням світла може пройти відносно багато часу Для фосфоресценції характерні більша довжина хвилі випромінювання, менша інтенсивність і більший вплив матриці 4">

Класифікація люмінесценції за способами збудження Електромагнітне випромінювання УФ- та видимого діапазону Фотолюмінесценція Потік електронів (катодні промені) Катодолюмінесценція Потік іонів лужних металів Іонолюмінесценція Рентгенівське випромінюванняРентгенолюмінесценція Радіоактивне випромінювання звукСонолюмінесценція Механічне впливТриболюмінесценція Енергія хімічної реакціїХемілюмінесценція 5

В аналітичній практиці частіше використовують фото- та хемілюмінесценцію Флуоресцентні вимірювання більш вибіркові, ніж спектрофотометричні, оскільки залежать від двох довжин хвиль: поглинається і випромінюваного світла У порівнянні з молекулярною абсорбційною спектроскопією метод має більшу чутливість. вихідний сигнал збільшується із збільшенням інтенсивності випромінювання Межі виявлення для більшості сполук складають ~мкг/мл, що на 1-2 порядки нижче, ніж в абсорбційній спектроскопії 6

Крім того, у ряді випадків спостерігається великий діапазон визначених змістів - іноді до 4-х порядків величин концентрацій - при тій же відтворюваності результатів аналізу, що і в молекулярної спектроскопії абсорбційної Все це зумовило розвиток люмінесцентного методу аналізу 7

Молекулярна люмінесцентна спектроскопія (флуориметрія) Фотопроцеси в молекулах Електронне збудження молекули пов'язане з переходом електрона з основного стану в збуджене з більшою енергією Збуджені молекули переходять в основний стан, часто випромінюючи світло енергії дещо затримується В кінцевому рахунку все ж таки відбувається швидкий перехід всіх збуджених станів в основний стан системи Походження люмінесцентного випромінювання пояснюється діаграмою Яблонського 8

Розглянемо процес збудження валентних електронів молекули На кожен електронний рівень або енергетичний стан (жирні лінії на схемі) накладаються коливальні підрівні з квантовими числами 0,1,2,3 і т. д. При поглинанні кванта світла електрон переходить з основного рівня на вищий. Розрізняють синглетний збуджений стан (усі спини електронів антипаралельні, неспарені електрони відсутні) та триплетний (паралельні спини) Основний стан не може бути триплетним (за принципом Паулі два електрони не можуть мати повний набір однакових квантових чисел) 10

Механізми повернення молекули зі збудженого стану в основний

При кімнатній температурі молекули зазвичай знаходяться в основному стані S 0, і майже всі переходи при поглинанні світла відбуваються з нижнього (основного) коливального підрівня на коливальні підрівні збудженого синглетного стану S 1 або S 2 Час життя електрона в збудженому синглетному стані молекула за рахунок так званої коливальної релаксації при зіткненні з навколишніми молекулами дуже швидко, за час менше, втрачає надмірну коливальну енергію і переходить на основний коливальний рівень збудженого синглетного стану (перехід позначений хвилястими стрілками) 13

Таким же швидким є процес внутрішньої конверсії у вищих електронно-збуджених станах Це безвипромінювальний перехід між коливальними рівнями різних електронних станів, що мають однакову енергію (горизонтальна хвиляста лінія) переходом S 1 S 0 Флуоресценція - процес випромінювального переходу з нижчого збудженого синглетного стану в основний (S 1 S 0) Час згасання флуоресценції з Флуоресценція протікає в одну стадію 14

Енергія фотона, що випускається, нижче, ніж енергія поглиненого фотона, тому спектр флуоресценції молекули знаходиться в області довших хвиль в порівнянні зі спектром поглинання - закон Стокса - Ломмеля h люм

18

Нагадаємо, що крім синглетного можливий триплетний збуджений стан (паралельні спини електронів) Прямий перехід з основного стану в збуджений триплетний внаслідок поглинання фотона практично неможливий безвипромінювальний перехід, позначений хвилястою стрілкою) Час життя електрона у збудженому триплетному стані – не менше ніж У триплетному стані так само, як і в синглетному відбувається коливальна релаксація, і електрон переходить на нижній коливальний рівень Т 1 20

Безвипромінювальна дезактивація Т 1 S 0 конкурує з випромінювальним Т 1 S 0 переходом Фосфоресценція – випромінювальний перехід між станами різної мультиплетності Хоча такі переходи теоретично заборонені, вони мають місце, хоч і менш ймовірні, ніж S S та ТТ переходи Це відбувається внаслідок спин - орбітальної взаємодії, пов'язаного з рухом ядер, тому зі збільшенням маси ядра спин - орбітальна взаємодія різко зростає (~Z 4) Т. о. ефективність фосфоресценції зростає при введенні в молекулу люмінофора (або розчинника) атомів з великими атомними номерами, наприклад, йоду або брому - ефект важкого атома 21

У розчинах це відбувається при зіткненні з молекулами кисню, що мають неспарені електрони Для спостереження фосфоресценції з розчинів видаляють кисень, більш ефективно заморожування розчинів, або закріплення2

24

За участю Т 1 - стану може здійснюватися ще один випромінювальний процес - уповільнена флуоресценція, що відбувається в результаті термічної активації молекул Т 1 S 1 і подальшим випромінюванням з нього. Умови прояву уповільненої флуоресценції досить специфічні. Цей тип молекулярної люмінесценції спостерігається в вельми обмежених діапазонах температур, в'язкостей і концентрацій розчинів. збігається зі спектром швидкої флуоресценції, проте час життя уповільненої флуоресценції дорівнює часу життя фосфоресценції 25

Спектр збудження люмінесценції - залежності інтенсивності люмінесценції I від частоти (хвильового числа) або довжини хвилі збуджуючого світла Спектр люмінесценції - залежність інтенсивності люмінесценції від її довжини хвилі I = f(λ); I = f(v) Час життя люмінесценції – час, за який інтенсивність випромінювання зменшиться в раз, оскільки згасання люмінесценції відбувається за законом: I t = I 0 e -t/ τ 27

Для збудження люмінесценції використовується УФ-випромінювання. Джерела випромінювання – газорозрядні лампи, найчастіше ртутно-кварцові та ксенонові Вимірювання люмінесцентного випромінювання найчастіше проводять під прямим кутом до падаючого променя світла, тому кювети повинні бути прозорі у всіх напрямках. служити очей людини. У сучасних приладах використовуються фотопомножувачі Для реєстрації фосфоресценції необхідний пристрій для охолодження проби та механічний або електронний переривник, що дозволяє опромінювати пробу короткими імпульсами і тим самим відокремлювати тривалу фосфоресценцію від короткочасної флуоресценції 31

C пектрофлуориметр фірми Horiba Fluoromax

В основі кількісного аналізу лежить залежність інтенсивності люмінесценції від концентрації люмінесцентної речовини де К - коефіцієнт пропорційності В кв - квантовий вихід люмінесценції I 0 - інтенсивність збуджуючого світла ε - молярний коефіцієнт поглинання l - товщина шару розчину Це співвідношення справедливо, якщо постійні: світла 34

10 -4 М лінійність графіка порушується з - за концентраційного гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. концентраціях >10 -4 М лінійність графіка порушується через концентраційне гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. Залежність інтенсивності флуоресценції" class="link_thumb"> 35 !}Залежність лінійна в межах 3-4 порядків величин концентрації (М) При концентраціях >10 -4 М лінійність графіка порушується через концентраційне гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. Залежність інтенсивності флуоресценції від концентрації флуоресцентної речовини 35 10 -4 М лінійність графіка порушується через - за концентраційного гасіння люмінесценції, самопоглинання ф3 > 10 -4 М лінійність графіка порушується через - за концентраційного гасіння люмінесценції, самопоглинання та інших. При концентраціях >10 -4 М лінійність графіка порушується через концентраційне гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. Залежність інтенсивності флуоресценції"> title="Залежність лінійна в межах 3-4 порядків величин концентрації (10 -7 -10 -4 М) При концентраціях >10 -4 М лінійність графіка порушується через концентраційне гасіння люмінесценції, самопоглинання та ін. Залежність інтенсивності флуоресценції"> !}

Гасіння люмінесценції відбувається при зіткненні збудженої молекули з іншими, особливо парамагнітними (розчинений кисень), які стимулюють процеси інтеркомбінаційної конверсії. Підвищення температури зменшує вихід люмінесценції. Це з тим, що зростає частота зіткнень, у яких відбувається безвипромінювальна дезактивація збуджених молекул. Тому визначення проводяться, як правило, при кімнатній температурі. Присутність сторонніх речовин також знижує вихід люмінесценції. Найбільш активні гасителі люмінесценції - катіони та аніони «важких» елементів (I -, Br -, Cs + та ін), парамагнітні іони та молекули (Mn 2+, O 2 та ін), молекули розчинника Самопоглинання - полягає в поглинанні частини випромінюваного світла шаром люмінесцентної речовини 36

Застосування методу 37 Кількість флуоресціюючих речовин обмежена. Метод застосовний для визначення речовин, що володіють власною люмінесценцією (сполуки U(VI), особливо ураніл - іона UO 2 +, РЗЕ та ін) іонів металів у вигляді комплексів з органічними реагентами: 8- оксихінолін та його похідні (понад 25 елементів, т. ч. Li, Ca, Mg, Ba, Sc, Al, In, Ga) оксиазо- та оксиазометинові сполуки (Al, Ga, Mg та ін) поліоксифлавони (Zr, Hf, Sn, Th, Al, Be) родамінові барвники (Au, In, Ga, Hg, B, Te та ін.) органічних речовин - конденсованих поліароматичних систем (антрацен, флуорен, флуоресцеїн)

38 кристалофосфорів або твердих розчинів. Зазвичай їх отримують спіканням основної речовини (ZnS, CdS, CaS, SrS та ін) з активатором (сполуки Ag, Cu, Mn, Ce та ін) і плавнем (NaCl, NaNO 3, K З l, CaF 2 та ін. ). У деяких випадках кристалофосфор вдається отримати сокристалізацією активатора та основної речовини з насиченого розчину останнього. Спектр люмінесценції кристалофосфору визначається типом активатора Кристалофосфори позначають хімічними символами основної речовини, що утворює кристалічну структуру активатора і плавня. Наприклад, запис ZnS × Ag × NaCl означає, що даний кристалофосфор являє собою сульфід цинку, активований атомами срібла, і при синтезі його використаний плавінь хлорид натрію

Наприклад, уран у кількості 10 -5 мкг можна визначити із застосуванням кристалофосфору на основі NaF, сурму в кількості 10 -6 мкг - на основі CaO, рідкісноземельні елементи в кількості 10 -6 мкг - на основі ThO 2 Чутливість визначення порівнянна, а іноді і перевершує атомно-спектроскопічні методи: селективність не дуже висока 39

Визначення органічних сполук засноване на а) прямих методах по флуо- і фосфоресценції; б) ефекті Шпільського; в) фосфоресценції при кімнатній температурі. цьому молекули ізольовані один від одного і жорстко закріплені в розчиннику, внаслідок чого спектри являють собою серію вузьких спектральних ліній і мають яскраво виражену індивідуальність.

Фосфоресценція органічних молекул зумовлена ​​дезактивацією збуджених триплетних станів. Час життя триплетних станів настільки велике (до 100 с), що з спостереження фосфоресценції необхідно зафіксувати молекулу в триплетном стані в жорстку матрицю, т. е. іммобілізувати. Для отримання спектрів фосфоресценції застосовують органічні розчинники, що кристалізуються при низьких температурах найчастіше використовують суміші: етиловий спирт - диметилформамід; етиловий спирт - ізопентан - діетиловий ефір, які кристалізуються в склоподібну масу при температурі кипіння рідкого азоту 77 К 44

45 Для вимірювання фосфоресценції при кімнатній температурі люмінофор закріплюють на сорбенті, обробленому солями Ag, Tl, Hg, бромідами, іодидами та ін. (ефект важкого атома) Сорбенти – фільтрувальний папір, оксиди кремнію того, підвищується селективність, тому що ефект важкого атома дуже специфічний

Якісний аналіз 46 Спектр люмінесценції є індивідуальною характеристикою люмінесцентної речовини. Спектри можуть використовуватися для якісного люмінесцентного аналізу. Зазвичай такий аналіз проводиться візуально за кольором випромінювання. Якісний люмінесцентний аналіз застосовують для дослідження мінералів, визначення марок стекол, сортів мастил і т. п. Дуже чутливі якісні люмінесцентні реакції, що використовуються для виявлення іонів. люмінесценція літію з 8-оксихіноліном виникає в присутності 0,1 мкг/мл Li, мідь відкривають по яскраво синій люмінесценції її сполуки з саліцилалазином при концентрації 0,05 мкг/мл і т.д.

Хемілюмінесцентний аналіз 47 Хемілюмінесцентне випромінювання спостерігається тоді, коли в ході хімічної реакції утворюється збуджена молекула, здатна люмінесцувати при переході в основний стан. збуджений стан і потім випустить квант світла (непряма або сенсибілізована хемілюмінесценція) Для збудження хемілюмінесценції у видимій області спектра потрібна енергія 160 кДж/моль. Це характерно для радикальних, ланцюгових та окислювально-відновних реакцій, що протікають за вільно-радикальним механізмом.

48 На практиці найчастіше використовують реакції окиснення ряду органічних речовин, таких, як люмінол (V), лофін (VI), люцигенін (VII) та ін. інгібувати хемілюмінесцентну реакцію Зміна інтенсивності при цьому пропорційно концентрації елементів Для виконання аналізу потрібно лише виміряти інтенсивність люмінесцентного випромінювання, що виникає, за допомогою фотопомножувача Оскільки єдиним джерелом випромінювання є хімічна реакція, розкладання світла в спектр не потрібно, т. е. не потрібні

49 Метод хемілюмінесценції використовується визначення неорганічних і органічних речовин з межею виявлення до 10 –8 %. Розроблено методики визначення платинових металів, Fe, Co, Ni, Cu, Cr та ін. з ПЗ до мкг/мл, але ці методики не мають високої селективності. . Реакції NO + O 2 NO 2 * + O 2 NO 2 * NO 2 + hv супроводжуються люмінесценцією з максимумом при 800 нм Чутливість визначення озону з барвником родаміном становить до % (1 ppb)

Атомно - флуоресцентна спектроскопія 50 Атомно - флуоресцентний аналіз метод елементного аналізу за спектрами атомної флуоресценції Аналізований зразок атомізують, атомний пар, що утворився, для збудження флуоресценції опромінюють потоком світла. Випускається збудженими атомами флуоресценцію (як правило, резонансну) реєструють Якщо потік світла містить кванти з енергією, що відповідає збудженню першого рівня, атом, що опромінюється, перейде в збуджений стан, а потім при поверненні буде випускати світло з довжиною хвилі, що відповідає резонансному переходу. Цей процес також називають резонансною флуоресценцією

51 Схема збудження флуоресценції: а і б резонансна флуоресценція з різних рівнів; в резонансна та стоксова флуоресценція; г резонансна та антистоксова флуоресценція; д каскадна флуоресценція; е ступінчасте збудження флуоресценції двома квантами (ν 12 + ν 23)

52 Залежно від кількості фотонів, що припадають на один акт збудження, механізм збудження може бути однофотонним або ступінчастим багатофотонним. нерезонансної флуоресценції (в – е) Нерезонансну флуоресценцію називають стоксовою, якщо фотон, що випускається менше поглиненого, і антистоксової, коли фотон, що випускається, більше поглиненого Якщо перехід зі збудженого стану в основне здійснюється шляхом послідовних переходів, кожен з яких супроводжується випусканням фотонів, то такий тип ф каскадною флуоресценцією (д) У реальних атомах число електронних енергетичних рівнів більше трьох. Для заселення будь-якого з них існує ряд можливостей за участю ступінчастих і каскадних переходів при зіткнювальних і випромінювальних процесах. Як правило, кількість ліній у спектрах атомної флуоресценції не перевищує десятка.

53 Для атомізації рідких зразків (розчинів) можна використовувати будь-який спосіб атомізації полум'я, аргонову високочастотну індуктивно - пов'язану плазму або електротермічні атомізатори (нагрівані електричним струмом графітові трубки, нитки, стрижні, тиглі) Атомізацію порошкоподібних проб здійснюють електротермічними іноді вносять у полум'я для додаткового нагріву парів проби атомизатор зазвичай поміщають в атмосферу аргону з метою збільшення виходу

55 Порушення атома відбувається під дією зовнішнього джерела випромінювання Частка збуджених атомів визначається не температурою атомізатора, як в АЕС, а інтенсивністю цього джерела Для вільних атомів величини квантових виходів, як правило, вкрай невеликі через високу температуру середовища, тому в АФС використовують потужні джерела випромінювання збудження флуоресценції використовують інтенсивні лампи з лінійним або безперервним спектром (лампи з порожнистим катодом або безелектродні), а також лазери з довжиною хвилі, що перебудовується Останнім часом метод АФС розвивається виключно в лазерному варіанті - ЛАФС Використання лазерів дозволило різко збільшити чутливість методу

56 Лазери або оптичні квантові генератори – це сучасні джерела когерентного випромінювання Фізичною основою роботи лазера служить явище вимушеного індукованого випромінювання Суть явища полягає в тому, що збуджений атом здатний випромінювати фотон під дією іншого фотона без його поглинання, якщо енергія останнього і після випромінювання При цьому випромінюваний фотон когерентний фотону, що викликав випромінювання (є його "точною копією"); надзвичайно висока ступінь його монохроматичності недосяжна в випромінюванні нелазерних джерел В результаті узгодженого, кооперативного випромінювання світлових квантів багатьма атомами робочої речовини відбувається посилення світла межах від часток милливатта до –10 13 Вт (в імпульсному режимі)

Гелій - неоновий лазер 58 У високовольтному електричному розряді внаслідок зіткнень з електронами значна частина атомів гелію переходить у збуджений стан. починається лавиноподібний процес розмноження ідентичних когерентних фотонів. Якщо кювета із сумішшю газів поміщена між високовідбивними дзеркалами, то виникає лазерна генерація Світиться промінь в центрі це не власне лазерний промінь, а електричний розряд, що породжує світіння, подібно до того, як це відбувається в неонових лампах Промінь проектується на екран праворуч у вигляді червоної крапки, що світиться

59 Аналітичним сигналом служить випромінювання в УФ - частини спектра, що випромінюється збудженими атомами Інтенсивність атомної резонансної флуоресценції в першому наближенні пропорційна концентрації випромінюючих частинок: I 0 - інтенсивність збуджуючого світла кв - квантовий вихід флуорес ценції k - коефіцієнт поглинання

60 Основною перешкодою при атомно - флуоресцентних визначеннях елементів є розсіяне випромінювання, яке виникає внаслідок розсіювання випромінювання від джерела збудження на атомах і молекулах аналізованого зразка Розсіяне випромінювання часто маскує слабкі сигнали резонансної флуоресценції хвилі аналітичної лінії збігаються з довжиною хвилі розсіяного світла Щоб уникнути перешкод, пов'язаних з розсіяним випромінюванням, для вимірювання використовують лінії нерезонансної флуоресценції У цьому випадку ефект збудження досягається лише за допомогою лазерів

61 Для реєстрації спектру флуоресценції застосовують світлосильні спектрофотометри з великим кутом.

66

69 Лінійчастий характер спектрів атомної флуоресценції забезпечує атомно-флуоресцентному аналізу високу селективність Лінії у спектрі атомної флуоресценції дуже вузькі, і це дає можливість визначати одночасно кілька елементів. Для цього навколо атомізатора встановлюють відповідне число світлосильних спектрофотометрів. Метод АФС легко автоматизується, вартість апаратури відносно невисока. сечі), різних хімічних сполук, для дистанційного визначення елементів у верхніх шарах атмосфери

Порівняння меж виявлення елементів (нг/мл) методами атомної спектроскопії Елемент ААС (полум'я) ААС (е/т) АЕС (полум'я) АЕС (ППТ) АЕС (ІСП) АФС 5 1 0,01 0,04 0,1 8 0,01 0,1 0,01 0,02 0,0002 0,01 2 0,5 0,3 0,2 0,01 0,003 0,1 0,8 0,4 0,6 0,5 0,09 0,9 0,4 0,2 0,001 0,8 70

Порівняння меж виявлення елементів (нг/мл) методами атомної спектроскопії Елемент ААС (полум'я) ААС (е/т) АЕС (полум'я) АЕС (ППТ) АЕС (ІСП) АФС Mg 0,1 0,02 0,02 0,9 0,1 0,8 0,0002 0,0005 0,005 0,02 0,08 0,004 0,05 0,03 0,2 0,007 0,05 0,001 0,2 ,5 2 0,5 45 0,003 0,01 0,04 0,2 2 0,1 0,2 10 1,5 0,1 0,4 0,06 0,1 0,

Ця робота зайняла перше місце в номінації «найкраща оглядова стаття конкурсу»-2014.

Як відомо, одного разу світлобув успішно відокремлений від темряви. З тим, що таке темрява, ще треба розібратися. Поки що намітилися лише деякі перспективи у цьому напрямі у зв'язку з вивченням темної матеріїі темної енергії. А ось світло людство давно і успішно вивчає та використовує, у тому числі як дослідницький «інструмент». Один із напрямків використання світла в експериментальних дослідженнях пов'язаний із явищем флуоресценції.За останні тридцять років використання різних методів, заснованих на реєстрації флуоресценції, у біологічних та медичних дослідженнях стрімко зросло. Зумовлено це появою як нових технічних можливостей - насамперед комп'ютерів та лазерів, - так і широкого спектру доступних флуоресціюючих молекул та молекулярних комплексів. Наче мікроскопічні репортериці сполуки повідомляють нам особливими світловими сигналами про властивості молекулярного світу, де вони перебувають. Флуоресцентна методологія забезпечила вирішення багатьох важливих завдань біології та медицини. Завдяки високій чутливості та порівняльній безпеці вона витіснила багато традиційних методів, пов'язаних із застосуванням радіоактивних речовин. Методи флуоресцентного аналізу використовуються як у фундаментальних дослідженнях для отримання нових знань про живе, так і у прикладних роботах у біотехнології, медичній діагностиці, криміналістиці та багатьох інших галузях. Що ж є флуоресцентні репортери? Яку інформацію можна отримати з їх допомогою із глибин мікросвіту? Як цю інформацію реєструють та аналізують? Але насамперед – що таке флуоресценція?

Флуоресценція: свічення, індуковане світлом

Деякі речовини після поглинання світла у певному діапазоні довжин хвиль починають випромінюватисвітло в іншому, більш довгохвильовому діапазоні. Вперше це явище було описане як видима зміна кольору розчинів деяких органічних сполук і мінералів при спостереженні не на просвіт (у світлі, що проходить), а під кутом до проходить світла. Так, наприклад, Девід Брюстер (Sir David Brewster) в 1833 помітив, що при освітленні білим світлом зеленого спиртового розчину хлорофілу від нього «відбивається» червоне світло. Пізніше, в 1845 році, Джон Хершель (Sir John Herschel) описав подібні спостереження - поява блакитного забарвлення у безбарвного розчину хініну сульфату при опроміненні сонячним світлом. У 1852 році Джордж Стокс (George Gabriel Stokes) виявив видимена око світіння мінералу флуоритупри його опроміненні невидимимультрафіолетовим випромінюванням. Враховуючи джерело походження свічення, що спостерігалося, він назвав це явище флуоресценцією, як він зазначив, за аналогією з терміном опалесценція, що описує явище дихроїзмув опалі. Важливо, що це терміни як відображають «історію» свого походження, але, що важливіше, позначають різні фізичні явища. Флуоресценція- це випромінювання, що виникає в молекулах речовини під впливом світла. Опалесценція -це розсіюваннясвітла, яке іноді супроводжується інтерференцією.

За своєю сутністю флуоресценція є одним з різновидів люмінесценції.Цим терміном описують усі явища випромінювання речовиною, спричиненого «збудженням» молекул різними факторами. Так, наприклад, у деяких хімічних реакціях виникає хемілюмінесценція. Хемілюмінесценцію в біологічних об'єктах називають біолюмінесценцією*. Є речовини, які випромінюють світло при збудженні електричним струмом ( електролюмінесценція), швидкими електронами ( катодолюмінесценція), γ-випромінюванням ( радіолюмінесценція) та інші. У цьому контексті флуоресценція відноситься до категорії фотолюмінесценції.

* - Нещодавно на «біомолекулі» вийшла чудова стаття, яка описує відкриття нового типу біолюмінесценції: « » . – Ред.

Здібні флуоресціювати атоми, молекули та молекулярні комплекси називають флуорофорамиабо флуорохромами. Зазвичай цими термінами користуються синонімами. Однак у ряді джерел під флуорохромами розуміють всі види флуоресціюючих молекул, а під флуорофорами - тільки флуоресцентний компонент (угруповання) великої молекули. У класичній монографії Дж. Р. Лаковиця використовується лише один термін - флуорофор, для всіх типів флуоресціюючих речовин. З метою одноманітності ми користуватимемося цим терміном. Зазначимо також, що в дослідницькій практиці ковалентно приєднаний до макромолекули флуоресціюючий компонент прийнято називати флуоресцентною міткою, а вільний флуорофор - зондом. Застосовувані в мікроскопії флуорофори зазвичай називають флуоресцентними барвниками. Нарешті, деякі автори почали використовувати термін біосенсорищодо флуорофорів, що використовуються в біологічних дослідженнях.

Фізичну природу флуоресценції зручно проілюструвати, користуючись діаграмою, яку запропонував польський фізик Олександр Яблонський у 1933 році, та яка носить його ім'я. На малюнку 1 представлено спрощену форму цієї діаграми.

Малюнок 1. Діаграма Яблонської, що ілюструє електронні процеси у молекулах-флуорофорах при поглинанні квантів світла Горизонтальні лінії- енергетичні рівні електронів: S 0- основний, збуджений стан; S 1- Синглетний збуджений стан; 0–3 - квантовані підрівні; Т 1, Т 2- квантовані рівні триплетного збудженого стану. Стрілками показані переходи електронів у різні енергетичні стани: П- поглинання світла, Фл, Фосф- випромінювання флуоресценції та фосфоресценції, відповідно, ВК- внутрішня конверсія, ІЧ- інтеркомбінаційна конверсія, ВР- Вібраційна релаксація.

При поглинанні фотонів певної енергії в молекулі флуорофору відбувається перехід електронів з «основного» (S 0) на один із підрівнів «збудженого» (S 1 , S 2 , ..., S n) стану з вищою енергією. Спин електрона при переході не змінюється, тому ці рівні називають синглетними. "Збуджений" стан нестабільний, і електрони швидко повертається на вихідний енергетичний рівень. Відбуватися це може кількома шляхами. Три з них – безвипромінювальні квантові переходи: внутрішня конверсія, інтеркомбінаційна конверсіяі вібраційна релаксація. Два інші супроводжуються випромінюванням світла - це флуоресценціяі фосфоресценція. При внутрішній конверсії енергія електрона зменшується до мінімального синглетного рівня. В ході вібраційної релаксації, яка спричинена переважно взаємодією з навколишніми молекулами, поглинена енергія може «розсіятися» у вигляді тепла до «основного» рівня. Інтеркомбінаційна конверсія призводить до зменшення енергії електронів із зміною спину. Такий енергетичний стан електрона називається триплетним. Флуоресценція виникає при переході з нижнього синглетного рівня в "основний" стан, а фосфоресценція - при переході в "основний" стан з триплетного рівня.

Зазначимо три важливі обставини.

• По-перше, ймовірності вищезазначених переходів різняться. Уявлення звідси дає порівняння часу, протягом якого здійснюється кожен із цих переходів, інакше кажучи, час перебування електронів у кожному з цих станів (таблиця 1). Що менше час, то вірогідніший цей перехід. Вочевидь, що флуоресценція і більше фосфоресценція - малоймовірні процеси. Це проявляється у порівняно слабкому світінні більшості флуорофорів навіть за інтенсивному опроміненні.
• По-друге, оскільки флуоресценція можлива при переході електронів в «основний» стан тільки з найнижчого синглетного рівня, то енергія випромінювання менша за поглинуту енергію. Тому спектр флуоресценції флуорофору завжди знаходиться у більш довгохвильовій ділянці порівняно зі спектром поглинання.
• І, нарешті, по-третє, стан електронів, що у вищевказаних процесах, залежить як від фізичних чинників довкілля, і від загальної електронної зміни молекули. Саме ця обставина і робить флуорохром. молекулярним репортером, який «мовою» флуоресценції повідомляє про фізико-хімічні умови свого оточення.

«Мова» флуоресцентних репортерів

Флуоресценція характеризується низкою параметрів, які змінюються залежно від фізичного оточення чи хімічної модифікації флуорофора. Ці параметри і є тією «мовою», якою передається інформація від флуоресцентного репортера. Якщо продовжити аналогію, то самі параметри подібно до слів набувають конкретного змісту лише за певної їх комбінації і в контексті. "Контекстом" для параметрів флуоресценції є умови їх реєстрації. Флуоресценція всіх флуорофорів має п'ять ключових характеристик: спектри поглинання та флуоресценції, а також квантовий вихід, час життя та анізотропія флуоресценції.

Кожен флуорофор має індивідуальні спектри поглинання та флуоресценції . Для ілюстрації на малюнку 2 представлені спектри Lyso Tracker TM Blue (Molecular Probes ®) та флуоресцеїну. Основними параметрами спектрів є інтенсивність флуоресценції, становище максимумів і так звана напівширина (ширина спектру лише на рівні половини максимуму). Часто саме ці параметри «інформують» про певні властивості оточення, де знаходиться репортер. Так, у спектрі флуоресценції багатьох флуорохромів виникають характерні зміни за різних рН середовища. На малюнку 2 як приклад показано рН-залежність спектру флуоресценції Lyso Sensor TM Yellow/Blue (Molecular Probes ®). Якщо такі специфічні, тобто. можуть бути викликані тільки зсувами рН, то флуорофор може бути рН-репортером. Lyso Sensor TM Yellow/Blue є одним із таких репортерів.

Квантовий вихід флуоресценції - це характеристика ефективності, з якою поглинена енергія трансформується у випромінювання проти процесами безвипромінювальної релаксації. Кількісно квантовий вихід визначається як відношення числа висвітлених фотонів до поглинених. Чим більший квантовий вихід, тим більша інтенсивність свічення флуорофору. Часто цей показник є вирішальним при виборі флуорофору роль флуоресцентного репортера. Наприклад, флуоресцеїн має квантовий вихід близько 0.9, що забезпечує його широке використання як у ролі самостійного зонда, так і в якості флуоресцентної мітки нефлуоресціюючих молекул. Важливо також те, що цей показник дуже чутливий до різних фізико-хімічних взаємодій репортера.

Час життя флуоресценції - це усереднений час, протягом якого молекули флоурофорів перебувають у збудженому стані перед випромінюванням фотонів флуоресценції. Вимірюється цей показник щодо загасання флуоресценції після короткочасного збудження. Час життя флуоресценції, з одного боку, дуже «чутливий» до фізико-хімічної «обстановки», де знаходиться флуоресцентний репортер. З іншого боку, цей показник є специфічною характеристикою флуорофору, що дозволяє отримувати «репортажі» від нього в присутності інших флуоресціюючих молекул зі схожими спектральними характеристиками.

Анізотропія флуоресценції - це кількісна характеристика залежності поляризації флуоресценції від поляризації збуджуючого світла. По анізотропії можна будувати висновки про обертальної рухливості репортера і цим про в'язкості середовища у його микроокружении.

П'ять зазначених параметрів флуоресценції є безпосередньо вимірюваними характеристиками випромінювання, яке «передають» репортери. Проте, інформаційні можливості флуоресцентних репортерів цим не обмежуються. З флуоресценцією пов'язаний ряд явищ, які використовуються як методичні «хитрощі» для отримання тієї чи іншої інформації від флуоресцентних репортерів.

Так, наприклад, існує явище безвипромінювальної (резонансної) передачі енергії (БПЕ) від одного флуорофору на інший. При цьому інтенсивність флуоресценції у донора енергії зменшується, а акцептор зростає. Відбуватися це може між флуорофорами з певними спектральними властивостями і, що особливо важливо, якщо вони знаходяться на досить близькій відстані. БПЕ є основою багатьох методичних підходів, дозволяють виявляти взаємодія молекул. Визначення ефективності безвипромінювальної передачі енергії дозволяє навіть оцінювати відстань між молекулами. У зв'язку з цим БПЕ іноді називають "молекулярною лінійкою" (див.: « » ).

Ряд методичних можливостей базується на гасінні флуоресценції. Гасіння може бути викликане фізичною взаємодією флуорофору з молекулами-гасниками - такими, як кисень, галогени, аміни, а також деякі "електрон-дефіцитні" органічними молекулами. І тут флуоресцентний репортер може «повідомляти» про присутність у його оточенні певних «гасителів».

Гасіння флуорофору може відбуватися також за рахунок фотознебарвлення під впливом випромінювання великої інтенсивності. Найчастіше з погляду реєстрації флуоресценції це негативне явище. Однак "в умілих руках" це явище використовується як спеціальний методичний прийом. Широке поширення у вивченні в'язкості та/або дифузійних властивостей цитоплазми клітин набула методика відновлення флуоресценції флуорофору після фотознебарвлення. Сутність її полягає в тому, що в невеликій ділянці клітини, що містить флуорофор, проводиться його знебарвлення короткочасним потужним спалахом лазера. Потім реєструється відновлення флуоресценції в тій самій ділянці, що зумовлено дифузними з інших областей клітини не знебарвленими молекулами флуорофору. За динамікою цього процесу характеризують дифузійні властивості цитоплазми.

Флуоресцентні репортери, які вони?

Здатність флуоресцировать мають багато речовини з певними конфігураціями електронів. Такі зміни складаються у деяких атомах, молекулах та надмолекулярних комплексах. Проте потрібні спеціальні дослідження виявлення потенційної «здатності» флуорофора виступати у ролі молекулярного репортера для біологічних і медичних досліджень. «Здібності» ці оцінюються за специфічністю інформації, яку вони передають, їхньої стабільності, насамперед фотостабільності, у ряді випадків враховується токсичність для окремих клітин або організму. Особливістю флуоресцентних «кореспондентів» є їхня висока індивідуальна «спеціалізація». «Спеціалізація» кожного репортера характеризується взаємодією з певними компонентами біологічної системи, а також специфічністю флуоресцентних сигналів. Умовно можна виділити дві групи репортерів, створених на основі органічнихі неорганічнихфлуорофорів.

Органічні молекули-флуорофорипредставляють найбільш численну та різноманітну групу флуоресцентних репортерів. Наскільки велика ця різноманітність, можна оцінити, заглянувши в каталог фірми Molecular Probes, що спеціалізується на розробці та виробництві флуорофорів з 1975 року. Це вже одинадцяте видання (оновлення) каталогу (на момент написання статті), що свідчить про високі темпи розвитку цієї галузі.

Велика різноманітність органічних флуоресцентних репортерів обумовлена ​​широким спектром завдань та умов їх застосування. При виборі або розробки репортерів беруться до уваги інформація, яку потрібно отримати, спектральні властивості флуорофору, а також спеціальні умови, пов'язані з особливостями досліджуваної системи. Проілюструємо це на прикладі флуоресцеїну та його похідних (рис. 4). Як зазначалося, цей флуорофор має високий квантовий вихід і, відповідно, яскраву флуоресценцію. Він може у ролі репортера рН. Однак, наприклад, для вимірювання рН усередині клітин він не підходить, тому що. не проникає крізь цитоплазматичну мембрану. Його «доставка» до клітин може бути здійснена з використанням гідрофобного похідного - флуоресцеїндіацетату, який втратив здатність флуоресціювати, але може проникати через гідрофобний бар'єр цитоплазматичної мембрани. У клітинах естерази відщеплюють ацетильні угруповання, і флуоресцеїн виявляється у клітинах. Аналогічним чином доставляється клітини дихлорфлуоресцеин, тобто. через естерифіковане похідне. Цей репортер служить для реєстрації наявності у клітинах активних форм кисню. Введення ізотіоціанату в молекулу флуоресцеїну дає можливість приєднувати флуорохром до аміногруп не флуоресціюючих молекул. З використанням флуоресцеїнізотіоціанату створюються високоспецифічні флуоресціюючі білкові репортери - різні антитіла, стрептавідин (реагент на біотин), а також нуклеотиди та олігонуклеотиди. Нарешті, 5-карбоксиметокси-2-нітробензиловий ефір флуоресцеїну (не показаний на рис. 4) являє собою не флуоресцентне похідне, яке може перетворюється на звичайний флуоресцеїн при опроміненні світлом з довжиною хвилі 355 нм. Це приклад фотоактивованих флуорофорів, флуоресцентні властивості яких хіба що «заховані» (англ. «caged») до опромінення.

Малюнок 4.Структурні формули флуоресцеїну та деяких його похідних.

У сімдесятих роках ХХ століття співробітник Прінстонського університету (США) Осаму Симомура ( Osamu Shimomura) щодо біолюмінесценції медузи Aequorea victoriaвиділив два білки, що у цьому процесі. Він встановив, що при взаємодії іонів кальцію з одним із виділених білків виникає хемілюмінесценція блакитного кольору. При цьому другий білок може поглинати блакитне світло і флуоресціювати зеленим світлом, що надає зеленого відтінку світіння медузи. Перший білок було названо екворином, другий зеленим флуоресцентним білком (ЗФБ). З цього моменту починається історія однієї з найуспішніших розробок молекулярної біології, а її основні герої – Осаму Симомура, Мартін Чалфі ( Martin Chalfie) та Роджер Тсьєн ( Roger Tsien) у 2008 році були удостоєні Нобелівської премії в галузі хімії за відкриття та детальне вивчення ЗФБ . Чим же чудовий цей білок?

Після відкриття ЗФБ почалися інтенсивні дослідження його структури, синтезували і клонували відповідний йому ген. Крім того, у деяких морських безхребетних ( Hydrozoaі Anthozoa) були виявлені аналогічні флуоресцентні білки, структура яких також була охарактеризована. Все це дозволило за допомогою методів молекулярної біології цілеспрямовано конструювати гени, що кодують модифіковані форми ЗФБ з широким діапазоном спектральних характеристик, а також фоторегульовані варіанти, світіння яких можна «включати і вимикати» шляхом опромінення ультрафіолетовим випромінюванням. В даний час можна говорити про те, що на основі ЗФБ створена і продовжує збільшуватися ціла армія різноманітних флуоресцентних білків (ФБ). Можливість застосування ФБ показана у дослідженнях багатьох видів клітин від бактерій до ссавців.

Дещо «скромніше» порівняно із ЗФБ поки виглядає «доля» екворину. Його структура також була встановлена ​​і синтезована ДНК, що кодує цей білок. Вивчення залежності хемілюмінесценції екворину від іонів кальцію дозволило розробити методики вимірювання концентрації катіону в деяких клітинах. Для вимірювання вмісту іонів кальцію усередині клітин існують і флуоресцентні репортери, у тому числі похідні ФБ. Однак гідністю хемілюмінесцентного методу з використанням екворину є відсутність необхідності опромінення, що збуджує флуоресценцію, яке не завжди є нешкідливим для біологічної системи, та й для флуорофорів, світіння яких при тривалому опроміненні послаблюється (ефект фотознебарвлення). Екворин відносять до порівняно великої групи про люциферинів - речовин, відповідальних за био(хеми)люминесценцию в деяких морських і наземних організмів. Вивчення люциферинів становить інтерес не тільки з метою їхнього практичного застосування. Адже досі не відомо, навіщо біологічним об'єктам взагалі потрібна біолюмінесценція.

В останні роки помітно зріс інтерес до створення флуоресцентних репортерів на основі неорганічнихфлуорофорів шляхом формування так званих біокон'югатів,тобто. їх комплексів з деякими органічними сполуками та/або з біологічними молекулами. Багато атомів, наприклад, перехідні метали, лантаніди (точніше їх іони, наприклад, Tb 3+ і Eu 3), кластери з кількох атомів золота і срібла після утворення таких комплексів набувають здатності до сенсибілізованоюфлуоресценції. Сутність явища полягає в тому, що енергія світла, поглиненого органічною сполукою, передається на атом неорганічного елемента, який випромінює флуоресценцію. Важливою властивістю цього процесу є те, що молекули-донори енергії передають її від електронів, що перебувають у триплетному стані. Тому випромінювання неорганічнихфлуорофорів у такому комплексі є «уповільненим» порівняно із «звичайною» флуоресценцією, оскільки час життя електронів у триплетному стані помітно більший, ніж у синглетному (див. табл. 1). Крім того, спектри флуоресценції неорганічних біокон'югатів мають невелику ширину та сильно зрушені щодо спектрів поглинання. Сенсибілізована флуоресценція репортерів-біокон'югатів робить їх корисними з точки зору техніки реєстрації випромінювання. Так, зокрема, вони використовуються в умовах, коли досліджувана система має «звичайну» флуоресценцію інших компонентів у тому ж діапазоні довжин хвиль.

Особливе місце в цій групі займають репортери-біокон'югати, в яких флуорофором використовуються напівпровідникові кристали розміром 2-10 нм (нанокристали), що отримали назву квантових точок* (Англ. quantum dots). Квантові точки зазвичай складаються з пари елементів III/V (наприклад, CdS, CdSe, ZnS) або II/VI груп (наприклад, GaN, InP, InAs). Внаслідок малих розмірів напівпровідникових кристалів (в них лише 10–50 атомів!) для їх електронів створюються умови квантованих енергетичних переходів, подібних до тих, що існують в окремих атомах. (Квантові точки іноді навіть називають "штучними атомами"). Причому енергія цих переходів, а цим і довжина хвилі флуоресценції, залежить від розміру кристала. Що менше кристал, то більше вписувалося енергія випромінювання, тобто. менше довжина хвилі флуоресценції (рис. 5). Ця властивість відкриває можливість створення квантових точок, що мають практично будь-яку спектральну конфігурацію. До цього слід додати, що вони, порівняно з органічними флуорофорами, мають ще й вищий квантовий вихід і фотостабільність. На рис. 6 показані зразкові розміри різних флуорофорів-репортерів.

* - Кого зацікавила ця назва, прочитайте докладну статтю « » . – Ред.

Малюнок 5.Флуоресценція колоїдних розчинів квантових точок різного розміру.

Біокон'югати на основі квантових точок складаються з ядра (наприклад, CdSe), покритого шаром напівпровідникового матеріалу (наприклад, ZnS), що виконує «захисну» функцію, і ліганда - якоїсь органічної речовини, що забезпечує розчинність та/або приєднання біологічних молекул.

Малюнок 6.Відносні розміри флуоресцентних репортерів Для порівняння показано також білок імуноглобулін G (Ig G).

Біоорганічна оболонка біокон'югату забезпечує його стабільність як колоїдної частинки та формує «завдання» репортера, його цільове призначення: де і з чим провзаємодіяти, яку «збирати та передати» інформацію. При цьому, звичайно, розміри репортера на основі квантової точки можуть суттєво збільшитися (на рис. 6 показані приблизні розміри квантових точок без спорядження біокон'югату). У біоорганічну оболонку можуть бути включені низькомолекулярні сполуки - такі як біотин - та високомолекулярні: одноланцюгові фрагменти ДНК (олігонуклеотиди) та білки, у тому числі ферменти та антитіла (Ig G).

Інструменти для читання флуоресцентних репортажів

У списку інструментів для отримання та аналізу «повідомлень» флуоресцентних репортерів історично першим є наше око. З його допомогою можна проводити візуальні спостереження флуоресцентного світіння на макроскопічних об'єктах безпосередньо, але в мікроскопічних - з допомогою флуоресцентного (люмінесцентного) мікроскопа. Прикладом макроскопічних об'єктів можуть бути колонії мікроорганізмів, в яких експресовані ФБ, хроматограми та електрофореграми із застосуванням флуоресцентних барвників. А в «звичайний» флуоресцентний мікроскоп (про «незвичайні» мікроскопи трохи далі) найчастіше заглядають для виявлення імунологічних реакцій з використанням мічених флуорофорами антитіл, а також у деяких дослідженнях на рівні поодиноких клітин. Однак можливості зорового аналізу суттєво обмежені в основному якісноюоцінкою «сигналів» флуоресцентних репортерів: «є свічення - немає свічення» у певній галузі зразка. Набагато більше інформації можна отримати, якщо «читати та розшифровувати» флуоресцентні «репортажі» кількіснимхарактеристикам світіння (див. розділ «Мова» флуоресцентних репортерів).

Для кількісної характеристики флуоресценції необхідні вимірювання з використанням спеціальних приладів та певної методології. Умовно можна виділити дві методології вимірювання параметрів флуоресценції. Перша служить для вимірювання різних характеристик флуоресценції у порівняно великій (макроскопічній) області об'єкта, що забезпечує отримання інтегральних ( усереднених) характеристик флуоресценції за об'єктом: розчином, суспензією колоїдних частинок, клітин, субклітинних частинок і т.п. Друга методологія орієнтується на вимірювання на рівні одиничних мікроскопічних об'єктів- в першу чергу клітин та субклітинних частинок.

Вимірювання інтегральної флуоресценції проводять за допомогою спектрофлуориметрів (флуоресцентних спектрофотометрів) та планшетних флуориметрів ( англ. plate readers). Спектрофлуориметри – це, як правило, аналітичні прилади, на яких можна отримати всі основні характеристики флуоресценції. Планшетні флуориметри – це пристрої, розраховані на масові аналізи великої кількості зразків (стандартні планшети розраховані на 96, 384 чи 1536 зразків). Вимірювання в них здійснюються за декількома фіксованими характеристиками - наприклад, за інтенсивністю флуоресценції в певній спектральній області. Нещодавно з'явилися планшетні флуориметри з можливістю виміру параметрів згасання флуоресценції і тим самим оцінки часу життя флуорофорів у збудженому стані. Більшість методик з використанням планшетних флуориметрів ґрунтується на імунологічних реакціях або на аналізі розвитку культур клітин у моношарах.

Методологія вимірів флуоресценції одиничних мікроскопічних об'єктів також має два варіанти. Перший заснований на отриманні цифрових зображень флуоресціюючих мікрооб'єктів ( англ. fluorescence imaging) з подальшим їх комп'ютерним аналізом ( англ. computer image analysis). Другий – на «поштучному» вимірі флуоресценції мікрооб'єктів у потоці при проходженні через вузький капіляр спеціального приладу – проточного цитометра ( англ. flow cytometer).

Цифрові зображення флуоресціюючих мікрооб'єктів отримують з використанням флуоресцентної мікроскопії, яка нещодавно пережила справжню технічну революцію. Так, поряд зі стандартними флуоресцентними мікроскопами, суттєво вдосконаленими цифровими фотокамерами та комп'ютерами, розроблені принципово нові пристрої. Це передусім звані конфокальні мікроскопи (рис. 8). У конфокальному мікроскопі збудження та реєстрація флуоресценції здійснюються через мікроскопічний отвір, що відсікає «зайве» світіння, яке виникає поза фокусом об'єктива. Шляхом сканування цією «оптичною зіницею» у горизонтальній та/або вертикальній площині, реєстрації сигналів фотопомножувачем та обробки комп'ютером виходить просторове зображення флуоресцентного об'єкта. Така конструкція насамперед дозволяє отримувати більш чіткі порівняно зі стандартними мікроскопами двовимірні та тривимірні зображення. Крім того, на сучасних конфокальних мікроскопах можна проводити вимірювання параметрів згасання флуоресценції.

Малюнок 7.Конфокальний мікроскоп.

Ще один тип «революційних» мікроскопів функціонує всупереч основним фізичним принципам флуоресценції. Порушення атомів у них здійснюється світлом із довжиною хвилі більшедовжини хвилі флуоресценції... (див. розділ Флуоресценція: свічення, індуковане світлом). Насправді, основні закони фізики при роботі цих мікроскопів не порушуються. Просто при достатній інтенсивності світлового потоку з довжиною хвилі більше за довжину хвилі можливої ​​флуоресценції в один і той же атом одночасно можуть «потрапити» два фотони, поглинена електронами енергія подвоюється, і її виявляється достатньо для збудження флуоресценції. Тому такі мікроскопи називаються двофотонними. Одночасне «попадання» двох фотонів до одного атома - явище порівняно малоймовірне, і може відбуватися лише там, де світловий потік максимально сконцентрований, тобто. у фокусі об'єктива. Це і забезпечує високу роздільну здатність флуоресцентних зображень. До переваг, що відрізняє двофотонні від інших мікроскопів, відноситься також їх здатність реєструвати флуоресценцію у зразках на глибині до 1,5 мм (є повідомлення про проникнення і на велику глибину), а також можливість істотно зменшити несприятливу дію збуджуючого випромінювання як на об'єкти, що досліджуються, так та на флуоресцентні репортери.

Спеціальні аналітичні прийоми (так звана флуоресцентна кореляційна спектроскопія) дозволяють використовувати конфокальну та двофотонну мікроскопію для дослідження руху одиничних (!) флуоресціюючих молекул.

Однак «на вершині» сучасної оптичної мікроскопії за роздільною здатністю стоять так звані «наноскопи», тобто мікроскопи, що дозволяють розрізняти на зображенні об'єкти, що флуорескують, відстань між якими становить кілька нанометрів. Існує два типи таких пристроїв. Перший заснований на скануванні зразка двома вузькими пучками лазерного випромінювання. Оптичні властивості їх підібрані так, що один збуджує флуоресценцію в «потрібній» області, а інший пригнічує її в «непотрібній» області, що поруч. Розмір «потрібної» області може бути близько кількох нанометрів. Цей метод отримав назву STED-мікроскопія.

Принцип роботи другого типу наноскопів спирається можливість оптичного «включення і виключення» флуоресценції окремих флуорофоров. Отримують зображення одного й того зразка кілька разів, включаючи то одні, то інші молекули. Потім комп'ютер накладає зображення один на одного, і на сумарному зображенні можна побачити світіння кожної з прилеглих молекул. У «звичайному», нехай навіть і конфокальному, мікроскопі вони злилися б одна пляма, що світиться. Такий підхід назвали PALM-мікроскопією.

Флуоресцентні «репортажі», зареєстровані у вигляді цифрових зображень, «розшифровують», тобто витягують кількісну інформацію за допомогою спеціальних програм аналізу зображень. Так можна вимірювати інтенсивність флуоресценції та її просторовий розподіл, оцінювати спектральні характеристики випромінювання (псевдоспектральний аналіз), визначати кількість флуоресціюючих частинок (наприклад, клітин), характеризувати тимчасові та поляризаційні параметри флуоресценції.

Слід зазначити також естетичну інформативність флуоресцентної мікроскопії. Флуоресцентні репортери на мікрофотографіях відкривають нам чарівний світ химерного поєднання кольору та форм (див. рис. 8). Фірми-виробники мікроскопів Nikon та Olympus навіть проводять щорічні конкурси фоторобіт про мікросвіт у світлі флуоресценції. З галереями робіт-переможців у цих конкурсах можна познайомитись на сайтах Olympus BioScapes та Nikon Small World.

Малюнок 8. Флуоресцентні мікрофотографії із галереї щорічного конкурсу Nikon Small World. 1. Фібробласти миші. 2. Веслоногий рачок Temora longicornis. 3. Мітоз у клітинах легень тритону. 4. Клітини глії мозочка миші in vivo(Двофотонна флуоресцентна мікроскопія).

На відміну від флуоресцентних мікроскопів, проточні цитометри не дають можливості помилуватися флуоресцентними об'єктами. Як правило, це суспензії клітин, у яких знаходяться флуорофори. Сильна сторона проточних цитометрів – швидкість реєстрації сигналів від одиничних об'єктів. Звичайний комерційно доступний цитометр дозволяє вимірювати флуоресцентні сигнали від клітин зі швидкістю 1000 клітин на секунду, а спеціалізовані високопродуктивні - до 25000 клітин на секунду! Стандартний варіант роботи передбачає вимірювання кожного об'єкта від двох до десяти параметрів: світлорозсіювання і флуоресценції одного або декількох флуорофорів. Вимірювання великому масиві об'єктів дозволяють отримувати статистично достовірні результати щодо гетерогенності клітинних, зокрема, мікробних популяцій.

Поряд із звичайними проточними цитометрами існують прилади, які здатні фізично розділяти (сортувати) клітини за певними параметрами світлорозсіювання або флуоресценції. Це відкриває можливість подальшого вивчення певних субпопуляцій із застосуванням інших методів.

Про що повідомляють флуоресцентні репортери

Як уже зазначалося (див. розділ Флуоресцентні репортери), всі флуоресцентні репортери мають спеціалізацію, тобто. здатні вибірково характеризувати певні властивості біологічної системи. Зупинимося коротко на деяких категоріях «фахівців».

За допомогою низки флуоресцентних репортерів можна стежити за ферментативним каталізом. Як правило, це органічні флуорофори. Так, наприклад, створюють субстрати з ковалентно приєднаними флуорофорами, які починають флуоресціювати лише після вивільнення в ході реакції. Це і є «повідомленням» про перебіг ферментативного каталізу. Інший прийом – використання «профлуорофору», який стає флуоресцентним у результаті взаємодії з продуктом реакції. За допомогою флуоресцентних репортерів ферментативних реакцій досліджують динаміку процесів, а також їхню локалізацію в клітинах, тканинах, органах тощо.

Репортери, сформовані на основі антитіл, інформують про протікання імунологічних реакцій. Вони є фізичними комплексами або ковалентними сполуками флуорофорів з антитілами (імуноглобулінами). Як флуоресцентний компонент показана можливість використання всіх відомих органічних і неорганічних флуорофорів, включаючи квантові точки. Крім того, до антитіл можна приєднувати ферменти, що каталізують реакції з утворенням флуоресцентного продукту. За допомогою імунологічних флуоресцентних репортерів виявляють наявність у зразках певних білків-антигенів, а також їх локалізацію. Так, наприклад, показані на малюнку 8 (фото 1) мікрофібрил у фібробластах мишей виявлені за допомогою флуоресцентних антитіл.

Багато видів інформації можна одержувати з використанням ФБ. Розроблено методи створення генів гібридних білків, що містять ФБ як флуоресцентну мітку якогось природного білка або навіть нуклеїнової кислоти. Введення в клітини генів таких «гібридів» дозволяє за флуоресценцією визначати «адреси» локалізації молекулярних компонентів живих клітин, стежити за динамікою їх синтезу та переміщень. Існує рН-залежність флуоресценції ФБ-містять гібридних білків, що використовується для вимірювання внутрішньоклітинного рН. Перевагою таких рН-репортерів у порівнянні з іншими рН-чутливими органічними флуорофорами є можливість вимірювання рН всередині різних внутрішньоклітинних відділів (органел), куди «адресований» основний компонент «гібриду».

Особливий інтерес викликає застосування різних ФБ у поєднанні з методиками виміру флуоресценції, заснованими на БПЕ. Для вивчення взаємодії чи спільної локалізаціїу клітинах якихось двох білків до них приєднують два ФБ, підібраних так, щоб при їх зближенні був можливий ефект БПЕ. Подібним чином можна вивчати конформаційні (структурні) зміниу білках. З цією метою відповідні ФБ приєднують до різних ділянок білкової молекули. Поява ефекту БПЕ свідчить про зближення ФБ і тим самим конформаційних перебудовах в досліджуваному білку. На цьому принципі працює «конструкція» з трьох білків, яка використовується як індикатор вмісту іонів Са 2+ у живих клітинах. До неї входять два ФБ і Са 2+ -зв'язуючий білок кальмодулін між ними. При зв'язуванні Са 2+ конформація кальмодуліну змінюється, ФБ зближуються та дають сигнал БПЕ. Тут доречно помітити, що для реєстрації іонів Са 2+ усередині клітин існують і «прості» флуоресцентні органічні репортери. Білкові репортери можуть бути більш точно «адресовані» у певні внутрішньоклітинні компоненти або за допомогою мікроін'єкцій, або шляхом включення в структуру білка з певною внутрішньоклітинною локалізацією.

Чутливість флуоресценції до фізичних властивостей мікрооточення, в якому знаходиться молекули флуорофорів, дозволяє використовувати деякі з них як репортери різних параметрів внутрішньоклітинного середовища. Вимірювання внутрішньоклітинної в'язкостіґрунтується на залежності поляризації флуоресценції від обертальної дифузії репортерів. Завдяки спеціально відібраним репортерам вдалося виміряти в'язкість цитоплазми всередині деяких органел, а також гідрофобному шарі біомембран. Взаємодія деяких флуорофорів із біологічними мембранами залежить від різниці електричних потенціалів на них. За допомогою таких репортерів одержують відомості про величину мембранного потенціалу. Для виміру внутрішньоклітинної температурирозроблено кілька варіантів флуоресцентних репортерів на основі лантанідів, квантових точок, термочутливих полімерів та органічних флуорофорів. Найбільш вражаючі результати отримані від спеціально сконструйованих органічних флуорофорів, які здатні «повідомляти» температуру різних частин клітин, «зашифровану» в динамічних параметрах згасання флуоресценції.

Що нового про мікросвіт ми дізналися завдяки флуоресцентним репортерам?

Флуоресцентні репортери довго та успішно «служать» експериментальній біології та медицині. Тільки перелік різних варіантів їх застосування міг би скласти обсяг однієї статті. Однак є такі галузі, де вони відіграли ключову роль у вивченні принципових властивостей та явищ біологічних систем. Зазначимо деякі їх для ілюстрації.

З використанням флуоресцентних репортерів було експериментально доведено модель рідкокристалічної структури всіх біологічних мембран*. Згідно з цією моделлю, при структурній цілісності та забезпеченні бар'єру проникності для гідрофільних речовин біологічна мембрана досить «рідка», щоб у ній могли переміщатися «за призначенням» її окремі компоненти. Таке уявлення про біологічні мембрани дозволяє зрозуміти основні молекулярні механізми їх функціонування, а також властивості живих клітин у цілому.

* - У тому числі завдяки флуоресцентним технікам було встановлено, що мембрана є не просто пасивним «морем» фосфоліпідів, у якому плавають «острова» мембранних білків, а повноправним учасником багатьох найважливіших біофізичних процесів: « » . – Ред.

Механізми трансформації енергіїу клітинах також стали зрозумілими значною мірою завдяки інформації від флуоресцентних репортерів. Особливу роль тут відіграли флуорофори, що дозволяють реєструвати внутрішньоклітинний та внутрішньомітохондиральний рН*, а також різницю електричних потенціалів на мембранах. З їх допомогою насамперед було виявлено механізм поєднання енергодонорних реакцій окислення з енерговитратним синтезом аденозинтрифосфату (АТФ) – універсального донора енергії для більшості метаболічних процесів. Крім того, була вивчена природа накопичення різних речовин у цитополазмі та в клітинних органелах за рахунок мембранного електричного потенціалу та градієнта рН.

* - про пристрій флуоресцентного pH-сенсора див. « » . – Ред.

Життєдіяльність клітин забезпечується сукупністю скоординованих у просторі та часібіохімічні реакції. Ця координація здійснюється за рахунок специфічної взаємодії компонентів так званих сигнальнихсистем. Основні компоненти цих систем були ізольовані та охарактеризовані за допомогою методів традиційної біохімії та молекулярної біології. Однак лише з появою підходів, заснованих на застосуванні флуоресцентних репортерів, стало можливим отримувати відомості про просторово-часової організації сигнальних шляхівбезпосередньо у клітинах. Так, зокрема, можна реально стежити за просторовою динамікою взаємодії білків-компонентів сигнальних систем. Це дозволяє вивчати поширення, посилення та інтеграцію сигналів у клітинах. Більше того, стало можливим на рівні одиничних клітин оцінювати динаміку експресії генів, що дозволяє підійти до розвитку концепцій клітинної індивідуальності на противагу традиційним статистичним підходам. Слід зазначити також, що за допомогою флуоресцентних репортерів вдалося виявити невідомі раніше сигнальні компоненти. Наприклад, було виявлено важливу роль іонів Са 2+ як сигнального посередника у багатьох регуляторних реакціях.

У другій половині минулого століття у мікробіології виникла проблема, яку назвали «великою аномалією обліку мікроорганізмів за допомогою чашок Петрі». «Винниками» виявилися флуоресцентні репортери, два барвники нуклеїнових кислот – акридиновий помаранчевий та 4,6-діамідіно-2-феніліндол. У численних дослідженнях природних зразків постійно виявлялася невідповідність між даними про вміст мікроорганізмів, отриманими шляхом обліку по колоніях клітин, що розмножуються, на чашках Петрі, і даними прямого підрахунку мікроорганізмів, фарбованих флуоресцентними барвниками нуклеїнових кислот, за допомогою мікроскопії. Флуоресцентні репортери завжди виявляли значно більше мікроорганізмів, ніж аналіз із чашками Петрі. Для пояснення цих даних було висунуто дві гіпотези. Згідно з першою, частина клітин може бути в деякому стані «спокою» і не розмножується на чашках Петрі. Згідно з другою, умови культивування (склад середовища, температура та ін) не відповідають «потребам» деякої частини популяції для розмноження. Перевірка цих гіпотез показала, що ці можливості можуть реалізовуватися. Більше того, було дано поштовх до формування двох нових великих напрямів досліджень.

Перше пов'язане з вивченням так званого «життєздатного, але не культивується стану мікроорганізмів». p align="justify"> Особлива значимість цього напряму обумовлена ​​наявністю такого стану у багатьох патогенних для людини мікроорганізмів. У цьому вся стані вони хіба що «невидимі» для стандартних методів діагностики. Крім того, у цьому стані вони збільшують стійкість до лікарських препаратів.

Другий напрямок - це виявлення та вивчення мікроорганізмів безпосередньо в природних зразках (лат. in situ, буквально - на місці) шляхом прямого аналізу їх нуклеїнових кислот без попереднього одержання чистих культур, як це робилося раніше. Цей напрямок навіть отримав власну назву - метагеноміка. Завдяки методам метагеноміки, серед яких, до речі, деякі ґрунтуються на використанні флуоресцентних репортерів, з'явилася можливість по-новому оцінити біологічну різноманітність мікроорганізмів в окремих екосистемах та на Землі загалом. Ось так «невигадливі» репортажі двох флуоресцентних репортерів сприяли появі двох найважливіших напрямів досліджень у сучасній мікробіології.

Отже, флуоресцентні репортери сьогодні є великою армією різноманітних «фахівців», які вже мають славну історію в експериментальній біології та медицині. Їхні флуоресцентні репортажі дозволили краще «розглянути» ті куточки мікросвіту, куди може проникнути світло. Причому розглянути як візуально, а й з погляду розуміння фізико-хімічних і біологічних закономірностей. І все-таки дослідники, які працюють у галузі розробки та застосування цих «молекулярних помічників» вивчення мікросвіту, вважають, що це лише початок!

Відеозапис 5-го семінару Ради молодих вчених Інституту біоорганічної хімії РАН: «Технологія акустичного фокусування частинок у проточній цитометрії»;

Ліпідний фундамент життя ;

Нано-pH-метр ;

По той бік дифракційного бар'єру: Нобелівська премія з хімії 2014 ;

Пучков Є.О. (2014). Флуоресцентні репортери та їх репортажі. Хімія та Життя № 9 (2014) , 8–13. .

ГЛАВА 1.

Введення у флуоресценцію

Люмінесценція- випромінювання фотонів з електронно-збуджених станів - ділиться на два типи залежно від природи основного та збудженого станів , У синглетному збудженому стані електрон на енергетично вищій орбіталі і другий електрон на орбіталі з нижчою енергією мають протилежну орієнтацію спинів. Кажуть, що ці електрони спарені*. У триплетном стані ці електрони не спарені, тобто. їхні спини мають однакову орієнтацію. При поверненні електрона із збудженого синглетного стану в основне орієнтація його спина не повинна змінюватися. Зміна орієнтації спина необхідна при переході з триплетного стану в основний синглетний стан. Флуоресценція- це випромінювання, що відбувається при поверненні спареного електрона на нижчу орбіталь. Такі переходи квантовомеханічно "дозволені", а типові величини швидкостей випромінювання для них ~10 8 з -1. Високі значення швидкостей випромінювання призводять до часів згасання флуоресценції ~ 10 -8 с (10 нс). Час життя - це середній період часу, протягом якого флуорофор перебуває у збудженому стані. Фосфоресценція- це випромінювання, що відбувається при переході між станами різної мультиплетності **, як правило, зі збудженого триплетного стану до основного синглетного. Такі переходи не дозволені, і константи швидкості випромінювання малі. Типовий діапазон часу загасання фосфоресценції – від мілісекунд до секунд, що головним чином залежить від внеску інших процесів дезактивації. У цій книзі всюди ми насамперед розглядатимемо швидший процес флуоресценції.

У речовинах, що виявляють значну флуоресценцію, електрони переважно делокализованы і формально розташовані на сполучених подвійних зв'язках.

* Правильніше було б сказати, що спини цих електронів спарено. Спареними зазвичай називають електрони, що знаходяться на одній і тій же орбіталі, - Прим. ред.

** Мультиплетність стану називають величину т = 2s + 1, де s - сумарний електронний спин даного стану. Так, для синглетних станів т = 1 і s = 0, для триплетних - т = 3 та s = 1 - Прим.ред.

Структури деяких типових флуорофор представлені на рис. 1.1. Одним із широко поширених флуорофорів є хінін, який додають у тонізуючі напої. Якщо подивитися на склянку тоніки, виставленої на сонячне світло, часто можна побачити слабке блакитне свічення. Воно найбільш помітно, якщо на склянку дивитися під прямим кутом до напрямку сонячного світла, а також, якщо постійна діелектрична зменшена завдяки присутності добавок. Хінін, що збуджується ультрафіолетовим випромінюванням сонця, при поверненні в основний стан випромінює блакитне світло з довжиною хвилі близько 450 нм. Явище флуоресценції часто може бути зумовлене деякими добавками. Наприклад, зелене або червоно-оранжеве свічення, яке спостерігається іноді в антифризі, ймовірно, викликане слідовими кількостями флуоресцеїну або родаміну відповідно (рис. 1.1). Багатоядерні ароматичні вуглеводні, такі як антрацен або перилен, також флуоресціюють, чим може частково визначатися блакитна флуоресценція бензину. І нарешті, сильно флуоресцируют такі сполуки, як РРО та РОРОР, що використовуються у "сцинтиляційних" розчинах та біохімічних дослідженнях. Інші приклади будуть дано у книзі з посиланнями на корисні властивості індивідуальних флуорофорів. На відміну від молекул органічних ароматичних сполук атоми* переважно не флуоресцируют у конденсованій фазі.

МАЛ. 1.1. Структури типових флуоресціюючих сполук.

МАЛ. 1.2. Спектри поглинання та випромінювання флуоресценції перилену та хініну (за даними).

Спектри випромінювання не можуть бути правильно зображені одночасно в шкалі довжин хвиль та в шкалі хвильових чисел. У цьому випадку використано правильне зображення у шкалі хвильових чисел. Довжини хвиль наведені для зручності (див. гл. 2).

Єдиним помітним винятком є ​​група елементів, які зазвичай називають лантаноїдами [1]. Флуоресценція іонів європію та тербію викликана переходами електронів між f-орбіталями, які екрановані від розчинника вищими заповненими орбіталями.

Флуоресцентні спектральні дані зазвичай представляють у вигляді спектрів випромінювання. Спектр випромінювання флуоресценції- це залежність інтенсивності флуоресценції від довжин хвиль (нанометрах) чи хвильових чисел (см -1). Два типових спектри випромінювання флуоресценції наведено на рис 1.2. Спектри випромінювання сильно змінюються і залежать як від хімічної структури флуорофору, так і від розчинника, в якому розчинений флуорофор. Спектри деяких сполук, таких як перилен, мають чітку структуру, обумовлену окремими коливальними рівнями енергії основного та збудженого станів. Інші сполуки, такі як хінін, мають спектри без коливальної структури.

*Коливальна структура спектрів випромінювання визначається коливальними підрівнями основного, а не збудженого електронного стану (докладніше см„ нижче). - Прим.. peд,

1.1. Діаграма Яблонської

Поглинання і випромінювання світла добре ілюструє діаграма рівнів енергії, запропонована Яблонським [3], Основний, перший і другий електронні стани позначають S 0 , S, і S 2 відповідно (рис. 1.3). рівнів, що позначаються 0, 1, 2 і т. д. Вплив розчинника до уваги не приймається, воно буде розглянуто докладніше в гол. 7. Переходи між різними електронними рівнями позначені вертикальними лініями. Така вистава використовується, щоб наочно показати миттєву природу поглинання світла. Цей процес відбувається приблизно за 10 -15 с, час занадто короткий для помітного зміщення ядер (принцип Франка - Кондона).

Енергетична щілина між різними коливальними рівнями енергії видно зі спектру випромінювання перилену (див. рис. 1.2). Окремі максимуми випромінювання (а отже, і коливальні рівні енергії) відстоять один від одного приблизно на 1500 см-1. Відносне число молекул перилену, що знаходяться в коливальних станах 0 і 1, описується розподілом Больцмана:

Відношення R числа молекул у двох станах з різницею енергій Е дається виразом

R = e -  E/kT (1.1)

де k – константа Больцмана; Т - абсолютна температура, К. При кімнатній температурі 300 До відношення R дорівнює 0,01. Отже, більшість молекул перебуватиме в нижньому коливальному стані; саме такі молекули і поглинають світло.

МАЛ. 1.3. Діаграма Яблонської.

Через велику різницю енергій між рівнями S 0 і S 1 по суті, у жодних флуорофорів стан S 1 не може бути заселений термічним шляхом. Цікаво відзначити, що навіть мале термічно активоване заселення першого збудженого коливального стану молекул можна зареєструвати, використовуючи відмінність спектрів поглинання за різних температур.

За поглинанням світла зазвичай слідує кілька інших процесів. Порушення флуорофора, зазвичай, відбувається до деякого вищого коливального рівня станів (S 1 чи S 2). 3а деякими рідкісними винятками, для молекул у конденсованій фазі характерна швидка релаксація на нижній коливальний рівень стану S 1 . Цей процес називається внутрішньою конверсієюі відбувається здебільшого за 10 -12 с. Оскільки типові часи згасання флуоресценціїблизькі до 10 -8, внутрішня конверсія зазвичай повністю закінчується до процесу випромінювання. Отже, випромінювання флуоресценції найчастіше здійснюється з термічно рівноважного збудженого стану. Аналогічно поглинання зворотний перехід електронів на нижній електронний рівень також призводить до коливально збудженого стану (рис. 1.3). Термічне рівновагу досягається за час 10 -12 с. Цікавим наслідком такого розгляду є те, що спектр поглинання молекули відображає коливальну структуру збуджених електронних станів, а спектр випромінювання - коливальну структуру основного електронного стану. У більшості випадків електронне збудження не сильно змінює розташування коливальних рівнів енергії. Внаслідок цього коливальні структури, які у спектрах поглинання і випромінювання, подібні.

Молекули в стані S 1 можуть також піддаватися конверсії в перший триплетний стан Т 1. Випускання з Т 1 зване фосфоресценцією, зазвичай зрушене у бік більших довжин хвиль (менших енергій) порівняно з флуоресценцією. Конверсія S 1 в Т 1 називається інтеркомбінаційною конверсією. Перехід з Т 1 в основний стан заборонений, внаслідок чого константа швидкості такого випромінювання на кілька порядків менша за відповідну константу для флуоресценції. На випуск флуоресценції можуть впливати й інші фактори, не показані в явному вигляді на рис. 1.3: вплив розчинників, релаксація розчинника, гасіння, і навіть реакції, які у збуджених станах. Всі вони будуть детально розглянуті в наступних розділах книги.
1.2 Характеристики випромінювання флуоресценції

Для явища флуоресценції відомо кілька основних показників. Існують і винятки, але вони рідкісні. Якщо якась із нижче перерахованих характеристик відсутня у даного флуорофору, можна зробити висновок про деякі особливі властивості цієї сполуки,

1.2.1. Стокс зрушення

Зазвичай, завжди спостерігається зсув випромінювання щодо поглинання у бік великих довжин хвиль, тобто. втрата енергії (виключення – атоми в газовій фазі). Це вперше спостерігав Стоке в 1852 р. в Кембриджі [4], використовуючи при цьому апаратуру, принцип дії якої зображений на рис. 1.4. Джерелом ультрафіолетового збудження служило сонячне світло, пропущене через платівку з блакитного скла. Перед приймачем як жовтий фільтр стояв склянку з вином, Флуоресценція хініну лежить в області 450 нм і тому добре помітна неозброєним оком. Нині визначення величини стоксова зсуву використовують інші методи.

Втрати енергії між збудженням та випромінюванням незмінно спостерігаються для флуоресціюючих молекул у розчинах. Однією з основних причин виникнення зсуву стоксу є швидка релаксація на нижній коливальний рівень стану S 1 . До того ж зазвичай відбувається перехід на збуджені коливальні рівні стану S0 (див. рис. 1.3), що призводить до додаткової втрати коливальної енергії.

МАЛ. 1.4. Схема першої установки виявлення стоксового зсуву.

На додаток до цього стоксів зсув може бути ще більший завдяки впливам розчинника на флуорофори і реакцій у збуджених станах. У газовій фазі у атомів і молекул не завжди є стокси зрушення. Випуск без зсуву спостерігають тоді, коли концентрації газу досить малі для того, щоб збуджені молекули не зазнавали зіткнень з іншими молекулами до процесу випромінювання. Такі зіткнення призводять до релаксації. У рідкій фазі процеси зіткнення відбуваються безперервно.
1.2.2, Незалежність спектра випромінювання від довжини хвилі збудження

Спектр випромінювання флуоресценції зазвичай залежить від довжини хвилі збудження. При збудженні на вищі електронні та коливальні рівні надлишок енергії швидко витрачається, переводячи флуорофор на нижній коливальний стан.S 1 . Ця релаксація відбувається за час порядку 10 -12 с і є, мабуть, результатом сильного перекриття безлічі станів з приблизно рівними енергіями. Завдяки такій швидкій релаксації довжина хвилі збудження зазвичай не впливає на спектр випромінювання. Існують винятки (наприклад азулен), коли випромінювання може відбуватися як з S 2 -, так і з S 1 -стану. Крім того, збудження на червоному краї спектра поглинання часто веде до зсуву флуоресценції в довгохвильову область. Цей зсув обумовлений тим, що збудження на червоному краю спектру вибірково можливе для тих флуорофорів, які найбільше взаємодіють з розчинником.

1.2.1 Правило дзеркальної симетрії

Зазвичай спектр випромінювання флуоресценції є дзеркальним відображенням спектра поглинання, точніше, того поглинання, яке відповідає переходу з S 0 в S 1. Це особливо наочно у випадку перилену (див. рис. 1.2). Симетрична природа цих спектрів визначається тим, що і поглинання, і випромінювання обумовлені тими самими переходами, а також подібністю коливальних енергетичних рівнів станів S0 і S1. Для багатьох молекул різний розподіл електронів у станах S0 та S1 істотно не впливає на ці рівні енергії. Згідно з принципом Франка – Кондона, всі електронні переходи відбуваються без зміни міжядерної відстані. В результаті, якщо дана ймовірність переходу (фактор Франка - Кондона) між нульовим і другим коливальними рівнями максимальна при поглинанні, відповідний перехід буде найімовірнішим також у випусканні (рис. 1.5).

МАЛ. 1.5. Правило дзеркальної симетрії та фактори Франка – Кондона.

Необхідною умовою для дзеркальної симетрії є представлення спектрів поглинання та випромінювання у відповідних одиницях. Найкраща симетрія повинна існувати між модифікованими спектрами (v)/v та F(v)/v 3 , де  (v) - коефіцієнт поглинання, що відповідає хвильовому числу v, a F(v) - відносний потік фотонів в інтервалі хвильових чисел Δ v [5]. Відповідність між такими спектрами зазвичай спостерігається для ароматичних поліядерних вуглеводнів.

Незважаючи на те, що правило дзеркальної симетрії часто виконується, з нього існує багато винятків. Як приклад на рис. 1.6 наведено спектри флуоресценції дифенілу. У спектрі випромінювання видно коливальну структуру, яка відсутня в спектрі поглинання. Таке відхилення від правило дзеркальної симетрії зазвичай свідчить про різне геометричне розташування ядер переважно і збудженому станах.

МАЛ. 1.6. Спектри поглинання та випромінювання дифенілу.

Змішування ядер може відбутися до процесу випромінювання через великий час життя стану S 1 . У разі дифенілу, ймовірно, окремі кільця стають більш копланарними у збудженому стані, внаслідок чого спектр випромінювання стає структурованішим порівняно зі спектром поглинання. Дифеніл не тільки є прикладом відхилення від правила дзеркальної симетрії, він незвичайний ще й тим, що його спектр випромінювання має більш чітко виражену коливальну структуру, ніж спектр поглинання. Зазвичай спостерігається протилежна картина.

Крім геометричних перегрупувань відхилення від правила дзеркальної симетрії можуть викликати реакції в збуджених станах. Так, наприклад, для фенолу та тирозину спостерігається по дві смуги випромінювання, причому довгохвильове випромінювання більш помітно при високих концентраціях акцепторів протона (див, рис, 11,18). Величина рК а фенольної гідроксильної групи зменшується від 11 в основному до 4 стані в збудженому стані.

МАЛ. 1.7. Спектри випромінювання пірена та його ексимера (за даними).

Відносна інтенсивність максимуму флуоресценції ексимера (470 нм) зменшується при зниженні концентрації пірена від 6x10 - 3 М (верхня крива) до 0,9x10 -1 М (нижня крива).
Слідом за збудженням фенольний протон переходить до акцепторів протону в розчині. Залежно від концентрації цих акцепторів у спектрі випромінювання може переважати флуоресценція або фенолу, або феноляту. Примітно те, що навіть незважаючи на відсутність активних груп, багато поліядерних ароматичних вуглеводнів також вступають в реакції в збуджених станах. Так, наприклад, молекули пірена в збудженому стані об'єднуються в комплекси, які називаються ексімерами (скорочення від excited dimers - збуджені димери). Випускання ексимерів змішане в довгохвильову область порівняно з випромінюванням мономерів пірена, в ньому відсутня коливальна структура (рис.1.7). Комплекси, що утворюються у збудженому стані, називають ексіплекс.
1.3. Часи згасання та квантові виходи флуоресценції

Часто вимірюють часи згасання та квантові виходи флуоресціюючих сполук. Сенс цих параметрів добре видно із модифікованої діаграми Яблонського (рис. 1.8). На цій діаграмі ми детально не вказуємо окремі процеси релаксації, що призводять до релаксованого стану S 1 , а звертаємо велику увагу на процеси, які відповідальні за повернення в основний стан. Зокрема, нас цікавить константа швидкості випромінювальної дезактивації флуорофору (Г) та константа швидкості безвипромінювальної дезактивації у стан S 0 (k).

Квантовий вихід флуоресценції- це відношення числа випущених фотонів до поглинених. Обидві константи швидкості Г та k відповідають процесам зменшення заселеності збудженого стану. Частка молекул флуорофору, які дезактивуються з випромінюванням, а отже, і квантовий вихід визначаються виразом

Q = Р/(Р+k) (1.2)

Квантовий вихід близький до одиниці в тому випадку, якщо константа швидкості безвипромінювальної дезактивації набагато менша за константу швидкості випромінювання, тобто k « Г. Зауважимо, що енергетичний вихід флуоресценції завжди менше одиниці через стоксові втрати. Для зручності ми згрупували всі можливі процеси безвипромінної дезактивації одну константу швидкості k.

МАЛ. 1.8. Модифікована діаграма Яблонської.

Час життя збудженого стану визначається як середній час, протягом якого молекула перебувала у збудженому стані до того, як повернутися до основного стану. Зазвичай час згасання флуоресценції -10 нс, Для флуорофора, що описується діаграмою Яблонського (рис. 1.8), час згасання дорівнює

τ = 1/(Г+k) (1.3)

Необхідно пам'ятати, що випромінювання флуоресценції - це випадковий прохід.
цес і в повному обсязі молекули випускають фотони при t = τ. Час життя – це
середня тривалість перебування у збудженому стані. У примі
ре для одноекспоненційного згасання, наведеному в гол. 3, 63% молекул гине під час t = τ, а 37% - за час t > τ. Час життя флуорофору без безвипромінювальних процесів, зване власним часом життя *,τ 0 , дорівнює

τ 0 = 1/Г (1.4)

Звідси випливає звичайне співвідношення між квантовим виходом та часом
нім життя:

Q = τ / τ 0 (1.5)

Квантовий вихід та час життя можуть змінюватися під дією будь-яких факторів, що впливають на константи швидкості. Наприклад, молекула може виявитися нездатною флуоресцировать через велику швидкість внутрішньої конверсії чи мінімальної швидкості випромінювання. Сцинтилятори зазвичай вибирають за їхні високі квантові виходи, які є результатом великих значень Г. Їм зазвичай відповідають короткі часи життя, близько 1 нс. Флуоресценція ароматичних сполук, що містять групи N0 2 зазвичай слабка, в першу чергу через велику величину k. Перехід триплет-синглет заборонений по симетрії, і константи швидкості спонтанного випромінювання становлять ~10 3 с-1 або менше **. Оскільки значення k близькі до 10 9 с-1 квантові виходи фосфоресценції малі при кімнатній температурі. З рівняння (1.2) можна отримати квантові виходи фосфоресценції, що дорівнює 10 -6 .

* Правильніше називати його радіаційним (випромінювальним) часом життя. - Прим. ред.

** Автор наводить надто велике значення k для внутрішньомолекулярної безвипромінювальної дезактивації триплетних станів, яка зустрічається рідко – лише для молекул, що зазнають хімічних перетворень (зокрема, ізомеризації). Через спинову заборону безвипромінювальний інтеркомбінаційний перехід Т 1 → S 0 для більшості молекул має константи швидкості k 1.4. Анізотропія флуоресценції

Флуорофори переважно поглинають ті фотони, електричні вектори яких спрямовані паралельно моменту переходу флуорофору. Момент переходу має певну орієнтацію у молекулі флуорофора. В ізотропних розчинах молекули флуорофорів орієнтовані випадковим чином. При збудженні поляризованим світлом селективно збуджуються ті молекули флуорофору, для яких дипольний момент переходу при поглинанні паралельний електричному вектору збуджуючого світла (див. Розд. 5.2.1). Таке селективне збудження частково орієнтованого набору флуорофорів (фотоселекція) призводить до частково поляризованого випромінювання флуоресценції. Для кожного флуорофора моменти переходу для поглинання та випромінювання мають фіксовану орієнтацію, і кут між ними визначає максимальну вимірювану анізотропію r 0 див. рівняння (5.20)]. Анізотропія (r) та поляризація (Р) флуоресценції виражаються рівняннями

(1.6), (1.7)

де I || і I ┴ інтенсивності флуоресценції вертикально (II) та горизонтально (┴) поляризованого випромінювання у разі порушення зразка вертикально поляризованим світлом. Анізотропія і поляризація - це вирази того самого явища, тому їх можна взаємозамінювати, використовуючи рівняння (5.3) і (5.4). Деякі фактори можуть зменшувати вимірювану величину анізотропії до значень нижче максимального. Найпоширеніший з них - обертальна дифузія, яка відбувається за час життя збудженого стану і зміщує флуорофора, що випускає диполь. Вимірювання цього параметра дає інформацію про відносне кутове змішування флуорофора в інтервалі між поглинанням та випромінюванням. Перенесення енергії збудження між флуорофорами також призводить до зменшення анізотропії.

Припустимо, що єдиним суттєвим процесом, що призводить до зменшення анізотропії, є обертальна дифузія. Тоді вимірювана анізотропія визначиться виразом

,

де r 0 - анізотропія, яка повинна була б вимірюватися за відсутності обертальної дифузії, а φ - час кореляції для процесу дифузії, що визначається як

φ = ηV/kТ (1.9)

де η - в'язкість розчину; k – константа Больцмана; Т – абсолютна температура; V -об'єм фрагмента, що обертається. Розглянемо білок з молекулярною масою 50 000. Оскільки питомий об'єм білків становить 0,73 мл/г, можна легко підрахувати, що при 25° С у водному розчині (n = 0,00894 П) очікуваний час кореляції становить 13 нc для безводної сфери. Оскільки білки гідраговані, фактичний час кореляції, мабуть, має бути більшим. Однак суттєвим є те, що часи обертальної кореляції для більшості білків можна порівняти з типовими часами загасання флуоресценції. Тому результати вимірювання анізотропії флуоресценції залежать від усіх факторів, що впливають швидкість обертальної дифузії. Тому вимірювання поляризації флуоресценції широко використовують для вивчення гідродинамічних властивостей макромолекул.

1.5. Тимчасова шкала молекулярних процесів у розчині

Флуоресцентна спектроскопія – ефективний метод дослідження динамічних процесів у розчинах, що становлять інтерес для біологів. Така можливість пов'язана насамперед із часом життя збуджених станів. Внаслідок принципу Франка – Кондона абсорбційна спектроскопія може дати інформацію лише про усереднені характеристики основного стану молекул, що поглинули світло. Оскільки тільки ті мо-ієкули розчинника, які безпосередньо сусідять з поглинаючими частинками, впливатимуть на їх спектр поглинання, абсорбційна спектроскопія може дати інформацію лише про деяку середню сольватну оболонку розчинника, що сусідить з хромофором, і не відображає молекулярну динаміку.

На противагу цьому параметри флуоресцентної спектроскопії є чутливими функціями всіх процесів, що протікають за час збудженого стану, причому в цих процесах можуть брати участь молекули, що знаходяться в момент збудження на відстанях до 100 А від флуорофору. Хоча може здатися, що 10 нс - надто короткий проміжок часу, фактично це великий час у порівнянні з часом руху малих молекул у рідкому розчині. Обертальна дифузія пов'язаних з білками і мембранами флуорофорів також укладається в цей часовий діапазон.

Гасіння флуоресценції молекулярним киснем за механізмом зіткнень є показовим прикладом розмірів просторового та тимчасового діапазонів, що представляються часом затихання флуоресценції. Якщо флуорофор, що у збудженому стані, стикається з молекулою кисню, він повертається у основний стан без випромінювання фотона. Коефіцієнт дифузії кисню у воді при 25 ° С дорівнює 25 10 -3 см 2 /с. Середня відстань [(Δх 2) 1/2], на яку може дифундувати молекула кисню за 10 -3 с, визначається рівнянням Ейнштейна:

Δ x 2 = 2Dτ (1.10)

Відстань [(Δх 2) 1/2] становить ~ 70 Å, що порівняно з товщиною біологічної мембрани або діаметром білка. Для деяких флуорофорів часи життя досягають 400 нc, тому можна спостерігати дифузію молекул кисню на відстані понад 450 А. Навпаки, вимірювання поглинання дають відомості лише про безпосереднє оточення флуорофору і, отже, про миттєве середнє оточення.

Вплив молекулярної динаміки на спектри флуоресценції також виявляється під час розгляду енергій. Органічні молекули, як правило, поглинають світло в діапазоні довжин хвиль 200-500 нм, що відповідає енергіям від 140 до 60 ккал/моль. Після поглинанням у флуорофора змінюється (зазвичай зростає) дипольний момент. Якщо молекули розчинника також мають дипольні моменти, вони переорієнтуються навколо диполя збудженого стану, знижуючи цим його енергію. Цей процес називається релаксацією розчинника та відбувається у рідких розчинах за 10 -12 с. Релаксація розчинника може призводити до значних зсувів стоксів. У білках триптофанові залишки поглинають світло з довжиною хвилі 280 нм, а флуоресценцію випускають при -350 нм. Таким чином, за кілька наносекунд, що проходять до процесу випромінювання, витрачається 20 ккал/моль.

В основі будь-якого експерименту лежать вимір деякої величини та кореляція отриманих результатів з явищем, що становить інтерес для дослідника. Тимчасовий діапазон між поглинанням світла і подальшим його випромінюванням достатній для протікання декількох процесів, кожен з яких призводить до ослаблення спектральних спектральних характеристик флуоресценції. До таких процесів відносяться зіткнення з гасниками, обертальна та поступальна дифузія, утворення комплексів з розчинниками або з розчиненими речовинами та переорієнтація оточення молекули у збудженому стані із зміненим дипольним моментом. Ці динамічні процеси можуть впливати на анізотропію флуоресценції, квантові виходи, часи життя та спектри випромінювання. В результаті спектральні характеристики флуорофорів можуть дати велику інформацію про динамічні процеси, що протікають за час випромінювання флуоресценції.

1.6. Флуорофори

1.6.1 Природні флуорофори

З великої кількості молекул біологічних речовин багато хто є природними, або природними, флуорофорами. Ми коротко підсумовуємо інформацію про широко відомі флуорофори, що дає основу для наступних розділів. Такий конспективний виклад не є вичерпним.

БІЛКИ Триптафан - найбільш інтенсивно флуоресцентна амінокислота в білках. Близько 90% усієї флуоресценції білків зазвичай зумовлено триптофановими залишками. "Цей природний флуорофор вкрай чутливий до полярності навколишнього середовища. Спектральні зрушення часто є наслідком кількох явищ, серед яких можна виділити зв'язування лігандів, асоціацію білок - білок і денатурацію. Крім того, максимуми випромінювання білків відображають середню доступність їх триптофанових залишків. поглинають світло близько 280 нм, а максимуми спектрів флуоресценції лежать в області 320 -350 нм.

Тирозин інтенсивно флуоресціює в розчині, проте в білках його флуоресценція значно слабша. Денатурація білків зазвичай посилює випромінювання тирозину. Як і для фенолу, рак тирозину дуже сильно зменшується при збудженні, і може відбуватися іонізація в збудженому стані.

Нуклеїнові кислоти Нуклеотиди та нуклеїнові кислоти зазвичай не флуоресціюють. Проте є деякі винятки. tRNA Phe із дріжджів містить інтенсивно флуоресцентну основу, відому як Y-основу, яка має максимум випромінювання поблизу 470 нм, а час життя ~6 нc.

Кофактори NADH флуоресціює сильно, і максимуми його поглинання та випромінювання знаходяться при 340 і 450 нм відповідно. NAD + не флуоресціює. Час загасання флуоресценції NADH у водному буфері становить приблизно 0,4 нс. Флуоресцентною групою є відновлене нікотинамідне кільце, причому його флуоресценція частково загашена за рахунок зіткнень із залишком аденіну. При зв'язуванні NADH з білками квантовий вихід флуоресценції збільшується зазвичай у чотири рази. Таке збільшення виходу зазвичай інтерпретують як наслідок зв'язування NADH у витягнутій конформації, що підтверджується вивченням дифракції рентгенівських променів гідрогеназах.

РИБОФЛАВІН І FAD. Рибофлавін, FMN (флавінмононуклеотид) і FAD (флавінаденіндинуклеотид) поглинають світло у видимій області (-450 нм) і випускають в області 515 нм. Типові часи життя для FMN та FAD становлять 4,7 та 2,3 нс відповідно. Як і для NADH, флуоресценція флавіна динамічно гаситься аденіном. Далі, FAD також утворює комплекс-симссоциати , в яких флуоресценція флавна потушена аденіном (статичне гасіння). Флагопротеїни в основному не флуоресціюють, проте знову ж таки існують винятки.

1.6.2. Штучні фпуорофори

Часто природні флуоресцентні властивості макромолекул неможливо отримати з експерименту бажану інформацію. Так, наприклад, флуоресценція білка і навіть поляризація цієї флуоресценції не відображають явище, яке хочуть охарактеризувати кількісно.

ІЗОЦІАНАТИ ТА ІЗОЦІОЦІАНАТИ ФЛУОРЕСЦЕЇНУ ТА РОДАМІНУ. Ці барвники широко використовують як мітки для білків. Мічені флуоресцеїном імуноглобуліни – комерційні реактиви; їх часто використовують у флуоресцентній мікроскопії. Саме ці речовини вибирають через високі квантові виходи та стійкість до фото знебарвлення. Крім того, завдяки великим довжинам хвиль поглинання та випромінювання (рис. 1,9) зведена до мінімуму проблема фонової флуоресценції біологічних зразків і можна уникнути застосування кварцової оптики. Ізоціанатна або ізотіоціанатна групи знаходяться або в мета-, або в параположенні до карбокси-групи (див. рис, l.l). Комерційні мічені реагенти є сумішшю ізомерів. Ці барвники реагують насамперед із лізиновим чи цистеїновим ділянкою білків. Часи загасання флуоресценції барвників близько 4 нс, які спектри випромінювання мало чутливі до полярності розчинника. Ці барвники дуже підходять для кількісного визначення ступеня асоціації невеликих мічених молекул із білками на підставі зміни поляризації флуоресценції.

Дансілхлорид. Дансилхлорид (DNS-C1) широко використовують як мітку для білків (рис. 1.10), особливо в тих випадках, коли проводять вимірювання поляризації. Ця речовина давно відома [8] і має зручне вре-ся життя флуоресценції (~ 10 нс). На спектр випромінювання дансильної групи сильно впливає полярність розчинника.

МАЛ. 1.9. Спектри збудження та випромінювання бичачого γ-глобуліну. міченого зотіоціанатом флуоресцеїну (за даними [7]).

МАЛ. 1.10. Штучні флуорофори, що часто використовуються.

Нафтиламінсульфонові кислоти, 1-Аніліно-8-нафталінсульфоно-в'яка кислота (l,8-ATS або ANS), 2-n-толуїдинілнафталін-б-сульфонова кислота (2,6-TNS або TNS) та їх похідні часто використовують як нековалентно пов'язаних зондів для білків та мембран. Ці зонди майже не флуоресцируют у воді, але інтенсивно флуоресцируют або при розчиненні в неполярних розчинниках або коли вони пов'язані з макромолекулами. Низький квантовий вихід у водній фазі дозволяє в багатьох випадках не враховувати цієї частини флуорофору, що спрощує експерименти. Подібні флуорофори зв'язуються із сироватковими альбумінами, ліпопротеїнами, апоміоглобіном, імуноглобулінами та ліпідними бислоями. Місця зв'язування мають, мабуть, як полярну, так і неполярну природу.

Гідрофобні мембранні зонди. Ліпіди зазвичай не флуоресціюють. Мембрани часто мітять такими зондами, як перилен, 9-вінілантраЦен та 1,6-дифенілгексатрієн (DРН) (рис. 1.10). Ці зонди нерозчинні у воді та вбудовуються у гідрофобні ділянки мембран. Незаміщені багатоядерні ароматичні вуглеводні та DPH малочутливі до полярності розчинника. Їх використовують у першу чергу для оцінки внутрішньої в'язкості подвійних шарів за вимірами поляризації їхньої флуоресценції (розд. 5.7.1). Шляхом цілеспрямованої зміни хімічної будови зонди можуть бути локалізовані на вибраних ділянках мембрани. Одним із таких прикладів є триметиламонієва сіль DPH (ТМA-DPH). Вважають, що заряджений атом азоту призводить до локалізації ТМА-DPH в області ліпідно-водної межі мембран [14].

Інші зонди, як, наприклад, PATMAN (рис. 1.11), дуже чутливі до фазового стану ліпідних бислоев [9]. При температурі перебудови мембран спектр випромінювання РАТМАН спалюється на 40 нм у довгохвильову область: від 425 до 465 нм. Очевидно, цей зонд реагує на релаксацію мембрани навколо диполі збудженого стану флуорофора (розд. 8.6). Було запропоновано й інші зонди. Чутливість до потенціалу мембрани може бути пов'язана зі зміною орієнтації зонда або його локальної концентрації в мембрані, а також з впливом електричного поля електронний розподіл в зонді [11]. І нарешті, можна виділити зонди, які зазнають реакцій у збудженому стані. У збудженому стані зонд Р 2 -З 3 може утворювати внутрішньомолекулярний ексімер, і частка ексімерів, що утворилися, визначає в'язкість в їх найближчому оточенні.

Нуклеїнові кислоти. При введенні етиленового містка флуоресценція АТР та його похідних стає інтенсивнішою [12]. Такі похідні ε-АТР (рис. 1.11) чутливі до в'язкості розчинника мають високу граничну поляризацію флуоресценції, і часи загасання їх флуоресценції близькі до 23 нс. Нуклеотидні аналоги активні у багатьох реакціях, що каталізуються ферментами. Крім того, були синтезовані такі аналоги нуклеотидів з витягнутою конформацією, як лін-бен-зо-АМР.

Підсумовуючи, можна сказати, що флуоресценцією мають різноманітні молекули і спектральні властивості флуорофорів впливає низку чинників і процесів. Як наслідок цього, флуоресцентні методи корисні вивчення властивостей розчинів і біологічних макромолекул.

МАЛ. 1.11. Штучні флуорофори, що часто використовуються.