Spektralna snaga i karakteristike hromofora. Yablonskaya dijagram

Elektronska spektroskopija

u supramolekularnoj hemiji

Glavne sekcije:

Fizičke osnove glinenog svjetla i fotoluminiscencije

Tehnika blijeđenja i luminescencije elektronskih spektra

Aktuelne metode obrade spektroskopskih podataka

Primjena spektroskopije zamrznutih elektronada istraže moći supramolekularnih sistema

Eksperimentalne metode hemije visokih energija: Početni priručnik/Za prošlost. ed. M. Ya. - M.: Vid-vo MDU, 2009. - 824 str.

(ISBN 978-5-211-05561-2).

O.M. Ushakov / Samosastavljanje i fotokemija supramolekularnih sistema na bazi nezasićenih spojeva koji sadrže krunu // disertacija. doc. chem. nauke, IPGP RAN, Čornogolivka, 2006. - 263 str.

[email protected] )

Dodatna literatura:

E.N. Ushakov et al, Sendvič-tip kompleksa katjona zemnoalkalnih metala s bistiril bojom za miješanje dvije krune druge jedinice, J. Phys. Chem. A, 1999, vol. 103, str. 11188-11193.

(u elektronskom obliku, PDF fajl, [email protected] )

I. Fizičke osnove generiranja svjetlosti i fotoluminiscencije

Interakcija između svjetlosti i govora

Svjetlo se, očigledno, odlikuje dugim vijekom trajanja  i frekvencija  šta je povezano sa odnosom

de h - lagana fluidnost u vakuumu, n - Indikator slomljene sredine.

Hvilijeva teorija svjetlosti temelji se na tumačenju fenomena kao što su vibracije, savijanje, difrakcija svjetlosti itd. manifestacije u kojima svetlost ne bledi do sredine.

Međutim, da bismo opisali pročišćavanje i izražavanje svjetlosti kroz govor, potrebno je koristiti kvantnu teoriju, budući da se svjetlosna energija može apsorbirati u malim porcijama ili u kvantima. Energija , transportovan jednim kvantom svjetlosti, ili, drugim riječima, fotonom, određen je Planckovim jednadžbama:

de h - Postiina Planka. Ovu monohromatsku svetlost karakteriše ne samo intenzitet svetlosti, već i energija fotona.

Poliranje monokromatskog svjetla homogenom srednjom tvari, koja zamjenjuje supstancu koja blijedi svjetlost, podliježe Lambert-Beerovom zakonu:

de I 0 - Energija monohromatskog svetla koja za jedan sat padne na površinu govorne lopte; I - Energija koja je prošla kroz govornu loptu za jedan sat; l - Tovshchina lopta, cm; C - Koncentracija lake gline, mol/l;  – molarni koeficijent ekstinkcije (ektinkcije), l/(molsm), koji je zbog prirode supstance, pri niskim temperaturama.

U fotohemiji, za karakterizaciju gline, koristite koncept optičke debljine ( D , bezdimenzionalna količina)

Lambert-Beerov zakon se ne primjenjuje u ovim slučajevima, ako značajan dio molekula pređe u budnicu (na primjer, s vrlo visokim intenzitetom upadne svjetlosti). Usklađenost sa Lambert-Beerovim zakonom također predstavlja zabrinutost za slab intenzitet svjetla. Međutim, ova inspiracija je očigledna; U pravilu, smrad je povezan ili s nedovoljnom odvojenom opremom spektrometra, ili s takvim fenomenima kao što je asocijacija molekula.

Oštećeni elektronski sistemi

Kada koristimo riječ "svjetlo", nazivamo je poštovanjem optičke reprodukcije, vidljive ljudskom oku. Kriva spektralne osjetljivosti ljudskog oka nalazi se u rasponu od 400 £ l £ 750 nm. Maksimalna osetljivost postaje blizu 555 nm (svetlo zelena). Za fotohemiju je interesovanje za šire polje proizvodnje, koje se formalno može podeliti na sledeći način:

blizu ultraljubičastog (200 £ l£ 400 nm)

vidljivo (400£ l£ 750 nm)

bliski infracrveni prijenos vibracija (750£ l£ 1000 nm)

Kada se apsorbuje kvant svetlosti sa l = 200-1000 nm, probude se spoljašnji molekuli elektrona, što stvara hemijsku vezu; Njihovo buđenje može dovesti do hemijske transformacije. Ovaj spektralni opseg je fundamentalan za spektroskopiju gline i modifikacije svjetlosti.

Spectra poglinnannya

Spektar glinenog govora se sastoji od različitih intenziteta i širina. Sličnost ovih varijacija može se ilustrovati dodatnim energetskim dijagramima molekularnih orbitala (MO). Elektroni u većoj molekuli su razdvojeni u parovima u MO s različitim energijama. Dovgokhvilijeva muga u elektronskom spektru gline ukazuje na prijelaz elektrona iz gornjeg zauzetog MO (HOMO) u donji slobodni MO (LUMO). Glatke formacije sa većom energijom ukazuju na prelaze u visoko ležeće prazne MO (na primjer, S 0 S 2) ili prelaze iz zauzetih nižih MO (na primjer, S –1 S 1).

Struktura i oblik mrlja je uglačan

Glatke nijanse u glinenom spektru često zamagljuju strukturu pjesme. Stoga je kožni elektronski sistem predstavljen skupom različitih stanica za pirsing. Mali pokazuje količinu potencijalne energije dvoatomske molekule u glavnoj elektronskoj stanici iz internuklearnog područja (kriva S 0 ). Maksimumi na krivinama za glodalice za probijanje (  = 0, 1, 2, 3, 4) odgovaraju najčešćim inter-core sekcijama. Za nulti kolivalni mlin  = 0 Najviša internuklearna regija nalazi se u području krive minimalne potencijalne energije. Za više nivoe oscilovanja, najvažniji međunuklearni regioni se nalaze u blizini tačke preokreta oscilovanja.
Frankov princip Condon Da bi se objasnio osnovni intenzitet tranzicija između kolateralnih nivoa glavnih i probuđenih elektronskih stanja, koristi se princip Franka Condona. Ovaj princip se zasniva na činjenici da je elektronski prelaz veoma brz proces (~ 10 - 15 s), manji broj jezgara u molekuli (~ 10 - 13 s), tako da se tokom sata elektronske tranzicije, međusobni rast jezgara i njihovi impulsi se praktično ne mijenjaju. Stoga se elektron-kolijativni prijelazi mogu predstaviti vertikalnim linijama koje povezuju površinu potencijalne energije glavne. S 0 i probudio se S 1 elektronska stanica. Većina molekula na sobnoj temperaturi je na nultom nivou, tako da se fotoinducirani elektronski prelazi generišu sa samog ovog nivoa. Sa ovim proširenjem potencijalnih krivulja S 0 і S 1 Najnaprednija tranzicija sudara elektrona će biti ( 0  2 )-tranzicija. Intenzitet ( 0  0 ) - tranzicija je prilično mala, budući da se o ovoj tranziciji svjedoči međunuklearna udaljenost male snage.

U molekuli bogatoj atomima, kriva potencijalne energije se transformiše na površinu bogatu atomom, a jedan elektronski prelaz je u skladu sa odsustvom kolateralnih prelaza. Često su ovi kolateralni prijelazi bliski energiji i ukazuju na jedno tamno, široko zamračenje zemlje. Oblik ove linije, prote, određen je Franck-Condon principom.

Procesi opuštanja u elektronski probuđenim stanjima.

U rijetkim slučajevima, na sobnoj temperaturi, elektronima pobuđena stanja molekula podliježu brzim procesima relaksacije elektron-kovalentne energije. Osnovni procesi opuštanja: interna konverzija iz gornjih kampova za buđenje S n u donjem taboru buđenja S 1 (< 10  12 с) и Kolivalsko opuštanje u logoru S 1 , onda. disipacija viška energije u srednjem toku tokom interakcije probuđenih govornih molekula sa molekulima srednjeg dela (~10-11 s).

Ovi procesi se, dakle, generišu znatno više u suprotnosti sa procesom spontanog generisanja fotona. viprominuvalna deaktivacija probuđenog stanja S 1 (~10 - 9 s). Stoga je ovo obećavajući prijelaz iz postajanja S 1 do glavnog logora S 0 činovi fluorescencija , U pravilu krećem iz logora nultog kalibra. Na ovaj način, podzemni prijelaz sa uglačanim i oživljenim svjetlima je prijelaz između nulte kovalne razine glavnog i probuđenog stanja, koji se naziva ( 0  0 )-tranzicija. energija ( 0  0 )-prijelaz - najmanje kada se polira, a najviše kada se opere. hoću S 0 і S 1 Budući da iza energija postoje slične podjele kovalentnih rivalstava, fluorescentni spektar, po pravilu, blizu zrcalne slike Spektar je drugačiji, jer je spektar predstavljen skalom energije fotona.

Stokes ruin

Za savijanje molekula u rijetkim fazama ( 0  0 )-prijelaz u spektru fluorescencije ima manju energiju, nižu ( 0  0 )-prijelaz u spektru gline. Dakle, odmah nakon apsorpcije i oslobađanja fotona, molekul je u nebitnom stanju solvatacije. U neviskoznim agensima na sobnoj temperaturi dolazi do prijelaza probuđenog fluorofora u stanicu jednake solvatacije sve dok se foton ne oslobodi. Tom ( 0  0 )-prijelaz kada se svjetlo promijeni, ima nižu frekvenciju, nižu ( 0  0 ) - prijelaz pri poliranju. Premještanje fluorescentne mrlje u crveno područje dovgokhvili smuge naziva se glinenjem Stokes ruševine.

Višestrukost

Mnoštvo elektronike će postati drevno n+ 1, de n- Broj nesparenih elektrona. Molekularne orbitale molekula s malim brojem elektrona ispunjene su parovima elektrona s dugim ravnim spinovima. Mnogostrukost glavne strukture većine molekula sa istim brojem elektrona je tada jednaka 1. ovo singlets. Kada se elektron pomakne na gornju orbitu, njegov spin može izgledati orijentiran u istom ili paralelnom smjeru s elektronom koji je izgubljen na donjoj orbitali. Pošto je orijentacija spina očuvana, višestrukost probuđenog stanja, kao i glavnog, biće jednostruka. Baš kao i kod probuđenog elektrona, spin se direktno menja, stanje buđenja će se promeniti trojke. Na taj način, jedan glavni stadij predstavljen je različitim buđenjima pozornice - singlet i triplet.

Yablonskaya dijagram

Fizički procesi kao što su molekuli pobuđeni elektronom obično se predstavljaju kao dijagrami Jablonskog. Glavni nenasilni procesi dekontaminacije nižeg probuđenog stanja S 1 ê unutrašnja konverzija (prijelaz između stanja različite množine) i interkombinacija (prijelaz između stanja različite množine, na primjer, singlet-triplet prijelaz S 1  T 1 ). Interna konverzija S 1 S 0 - Čitav proces je ažuriran. Zato sam se probudio S 1 Procesi spontanog oslobađanja fotona (spontano oslobađanje) i fotokemijske reakcije mogu se spriječiti. Viprominivalni procesi omogućavaju fluorescenciju duž leđa, a fosforescencija je blokirana duž leđa.

Klasifikacija elektronskih prelaza

Elektronski spektri analizirani u UV i vidljivom opsegu daju važne informacije o strukturi i snazi ​​molekula pobuđenih elektronom. Poznavanje spektra glinenih smola i viskoziteta, fotoluminiscentne i fotohemijske studije. Ukratko razgovarajte o klasifikaciji elektronskih prijelaza

Elektroni u organskoj molekuli dijele se na molekularne -, - i n-orbitale. Na molekularnoj orbitali kože nalaze se dva elektrona koji imaju suprotne spinove. Kada je svjetlosna molekula pobuđena, elektron se kreće sa zauzete vezne orbitale na slobodnu orbitu, koja se širi. Takvi prelazi se označavaju prema njihovoj orbitalnoj prirodi: *, n*, * to n*.

Smuha poglinannya, zumovlení tranzicije * , važan je u vakuumskoj UV regiji< 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.

Tranzicijen  * Na to ukazuje potamnjenje UV regije. Na primjer, organske misli, šta da se osvetim n-Elektroni lokalizovani u orbitalama heteroatoma, O, N, S, apsorbuju UV svetlost u oblasti oko 200 nm.

Pidemo dalje * і n  * označava zamračenje u području srednjeg UV zračenja. Kada se formira više ligamenata mrlja, ovi prelazi se formiraju, pomičući se u blisku UV i vidljivu oblast spektra. Pomakni se n* su karakteristični za jedinjenja koja sadrže hromoforne grupe kao što su C=O, C=S, N=N; Ovi prijelazi često izgledaju začepljeni, a ležišta gline mogu imati konstantno nizak intenzitet.

Ova klasifikacija se posebno odnosi na jednostavne molekule. U presavijenim molekulima, prijelazi elektrona mogu proizvesti elektrone koji se nalaze u različitim tipovima orbitala.

Steći značajan interes elektronski prijelazi sa prenesenog naboja. Budući da molekul ima elektron-donorsku i akceptorsku grupu, a oni su prisutni u -elektronskom dobitku, tada prijelaz S 0 S 1 može biti praćen i prenesenim nabojem sa donora na akceptor prema formaciji, kao, na primjer, u ovom nadimku styril bara:

Zašto govoriti o elektronskom prijelazu iz interno preneseno punjenje. Ove vrste mrlja odlikuju se visokim intenzitetom i razvijaju se u vidljivom, a ponekad i u bliskom IC području.

Za slabo vezane organske donorsko-akceptorske komplekse moguće je izbjeći glinovite naslage kako bi se dogodile prije elektronskog prijelaza sa prenesenog naboja sa donora na akceptor kroz prostor ( intermolekularni prijenos naboja). Takvi kompleksi se često nazivaju kompleksi za prijenos naboja. Dugotrajni smog takvih kompleksa može biti niskog intenziteta i može se pojaviti u skoro UV, vidljivom i bliskom IR području spektra.

U organometalnoj hemiji, čestice gline se odvajaju od naboja koji se prenosi sa liganda na metal ( PZLM) od metala do liganda ( PZML).

Luminescencija je svjetlost atoma, jona, molekula, koja je rezultat elektronskog prijelaza u ovim dijelovima kada se probude u normalu. Na taj način, molekul pretvara energiju gline iz snage proizvodnje (V.L. L'ovshin). Lumiscencija se naziva hladno svetlo.

Klasifikacija tipova luminescencije 1. Po intenzitetu sjaja 2. Po načinu aktivacije 3. Po mehanizmu sjaja: svijeća diskretnih centara - blijedi i viprominentni centri - iste čestice (atomi, molekuli i, ion ) rekombinacione svijeće - proces gline i prostora; Tokom procesa buđenja, jedan dio govora se dijeli na dva dijela; njihovu dalju rekombinaciju prati vidljiva energija A + hv A + + e A + + e A * A * A + hv 3

Klasifikacija luminescencije prema trivalitetu fluorescencije svjetlosti (~ 10 -8 s) Tokom fluorescencije, molekul je spriječen da pređe u glavni stupanj iz kratkotrajnog pobuđenog stanja odmah nakon što svjetlost izblijedi, očigledno se smanjuje i poznata je kao rezultat interakcije međumolekula sa drugim molekulima u području fosforescencije (>10 -6 s) Fosforescencija je spriječena prilikom prelaska molekule u glavni stupanj dugovječnog probuđenog stanja, tako da između poliranje i modifikacija svjetlosti može potrajati dosta vremena. Fosforescenciju karakterizira više vibracija u posljednjem trenutku, manji intenzitet i veća infuzija matrice 4. 10 -6 s) Fosforescencija je spriječena tokom prijelaza molekule u glavni stupanj dugovječnog probuđenog stanja, tako da između poliranja i modifikacije svjetlosti može proći dosta vremena fosforescenciju karakterizira intenzivnija rotacija. manji intenzitet i veća infuzija 4" matrice

Klasifikacija luminescencije prema metodama aktivacije Elektromagnetne vibracije u UV-vidljivom opsegu Fotoluminiscencija Tok elektrona (izmjena katode) Katodoluminiscencija Tok jona metala Jonoluminiscencija Propagacija rendgenskih zraka Propagacija rendgenskih zraka Radioaktivno širenje zvuka Mehanuluminescencija Tribohemijska energija Energija Sonoluminiscencija 5

U analitičkoj praksi se češće koriste fotografije i fluorescentno nijansiranje je selektivnije, niže spektrofotometrijsko, a fragmenti leže u dva oblika: izblijedjelo i istaknuto svjetlo. Metoda u poređenju sa molekularnom apsorpcionom spektroskopijom ima veću osjetljivost. Izlazni signal se povećava zbog povećanog intenziteta stimulacije Privremene detekcije za većinu rezultata iznose do ~µg/ml, što je 1-2 reda veličine niže, niže u apsorpcionoj spektroskopiji 6.

Osim toga, u brojnim vrstama postoji širok raspon vrijednosti pomaka - do 4 reda veličine koncentracije - s istom raznolikošću rezultata analize kao u molekularnoj spektroskopiji. Sve je to rezultiralo razvojem luminescentna metoda analize 7

Molekularna luminiscencijska spektroskopija (fluorimetrija) Fotoprocesi u molekulima Elektronska pobuda molekula povezana je s prijelazom elektrona iz glavnog stanja u pobuđeno stanje s većom energijom glatka tranzicija svih buđenja postaje glavna faza sistema. Obrazac luminiscentne vibracije je objašnjen dijagramom Jablonskog 8

Pogledajmo proces buđenja valentnih elektrona molekule pređite sa glavnog nivoa na viši. Postoji razlika između jednogodišnjeg stanja buđenja (svi okreti elektrona su antiparalelni, nespareni elektroni po danu) i trogodišnjeg (paralelni spinovi). Glavno stanje ne može biti trogodišnje (prema Paulijevom principu, dva elektrona ne mogu proizvesti novi skup novih kvantnih brojeva 1) 0

Mehanizmi za pretvaranje molekula iz probuđenog stanja u glavno

Na sobnoj temperaturi se očekuje da će molekuli biti u glavnom stupnju S 0, a tada su svi prijelazi kada se svjetlost ukloni iz niže (glavne) kovalentne faze u kovalentne faze probuđenog singletnog stupnja S 1 ili S 2. sat života elektrona u probuđenom singletnom stanju je molekul za takozvanu ljusku kolivalnu relaksaciju kada je u kontaktu sa dodatnim molekulima, čak i brzo, za manje od sat vremena, troši prekobrojnu kolivatalnu energiju i prelazi na glavni kolivatalni nivo probuđeni singlet kamp (prijelaz vrijednosti sa vijugavim strelicama 1) 3

Isti fluid je proces unutrašnje konverzije u većini elektronski pobuđenih mlinova. iz donjeg pobuđenog singletnog stanja u osnovno (S 1 S 0) Sat gašenja fluorescencije Fluorescencija se odvija u jednom stupnju 14

Energija fotona koji se oslobađa je niža, manja energija fotona gline, pa je spektar fluorescencije molekule u području oslobođenih vrijednosti u skladu sa spektrom gline - Stokes-Lommel zakon h lum

18

Pretpostavljamo da je pored singlet moguće tripletne faze buđenja (paralelni spinovi elektrona) direktan prijelaz iz glavnog okvira u trogodišnju fazu buđenja fotona praktički nemoguć, naznačen je neprelazni prijelaz vijugavom strelicom ) Životni vek elektrona u probuđenoj triplet stanici nije manji nego isti za triplet stanicu, jer u singletu dolazi do kovalentne relaksacije, a elektron se pomera na niži kovalentni nivo T 1 20

Neviprominivalna deaktivacija T 1 S 0 se natječe s viprominuvalnom T 1 S 0 tranzicijom Fosforescencija - viprominuvalna tranzicija između stanja različite multiplicitnosti Iako su takvi prijelazi teoretski blokirani, mogu se javiti Vrlo manje ozbiljni, niži S S i TT prijelazi su rezultat spina -orbitalne interakcije, povezane sa kolapsom jezgara, dakle, sa povećanjem mase jezgra, spin-orbitalna interakcija naglo raste (~Z 4) Dakle. Efikasnost fosforescencije se povećava kada se atomi sa visokim atomskim brojem, na primjer, jod ili brom, uvedu u molekul fosfora (ili originatora) - efekat važnog atoma 21

U vinima postoji kiselost koja je povezana s molekulima, što može rezultirati nesparenim elektronima.

24

Tokom T 1 dijela može se desiti još jedan progresivni proces - povećana fluorescencija, koja nastaje kao rezultat termičke aktivacije T 1 S 1 molekula i daljeg razvoja iz toga. Um će pokazati povećanu fluorescenciju i biti specifičan. Ova vrsta molekularne luminiscencije javlja se u širokim rasponima temperatura, viskoziteta i koncentracija spojeva. izbjegava spektar fluorescencije tekućine, nakon jednog sata života pojačane fluorescencije jednak je istom satu života fosforescencije 25

Spektar aktivacije luminiscencije - intenzitet luminiscencije I tip frekvencije (broj) ili do trajanja svjetla buđenja. Spektar luminescencije - intenzitet luminiscencije prizora u prošlom vijeku I = f(λ); I = f(v) Sat trajanja luminiscencije je sat tokom kojeg se intenzitet širenja mijenja za faktor ugašene luminiscencije prema zakonu: I t = I 0 e -t/ τ 27

Za buđenje luminescencije koristi se UV zračenje. Džerela viprominuvanja – gasne lampe, najčešće živino-kvarcne i ksenonske zatamnjene luminescentne viprominuvanije najčešće se obavljaju pod direktnim rezom na padajuće svetlo, tako da su kivete zaslužne za svačiji vid direktno Ix. služe očima naroda. U savremenim uređajima za snimanje fosforescencije koriste se fotomultiplikatori, neophodan je uređaj za hlađenje uzorka i mehanički ili elektronski izmenjivač, koji omogućava mešanje uzorka kratkim impulsima i na taj način pojačava fosfornu scenu od kratkočasovne fluorescencije 31

Sa spektrofluorimetrom Horiba Fluoromax

Osnova kvantitativne analize je intenzitet luminiscencije u odnosu na koncentraciju luminiscentne supstance de K - koeficijent proporcionalnosti V k - kvantni prinos luminescencije I 0 - intenzitet buđenja svjetlosti ε - molarni koeficijent gline l - umor lopta Ovo je pošteno, jer je konzistentno: svjetlo 34

10 -4 Linearnost grafika je poremećena usled koncentracijskog gašenja luminiscencije, samogašenja itd. Pri koncentracijama >10 -4 M, linearnost grafika je uništena zbog koncentracijskog gašenja luminiscencije, samogašenja itd. Stepen intenziteta fluorescencije" class="link_thumb"> 35!} Linearnost je linearna unutar 3-4 reda veličine koncentracije (M) Pri koncentracijama >10 -4 M, linearnost grafikona je uništena luminiscencijom koja gasi koncentracije, samogašenjem, itd. Zavisnost intenziteta fluorescencije u zavisnosti od koncentracije fluorescentne supstance 35 10 -4 M linearnost grafika je narušena kroz - za koncentracijsko gašenje luminiscencije, samogašenje f3 > 10 -4 M linearnost grafika je narušena kroz - za koncentracijsko gašenje luminiscencije, samogašenje i dr. . Pri koncentracijama >10 -4 M, linearnost grafika je uništena zbog luminescencije koja gasi koncentracije, samogašenja itd. Stepen intenziteta fluorescencije"> title=" Stepen linearnosti između 3-4 reda veličine koncentracije (10 -7 -10 -4 M) Pri koncentracijama >10 -4 M linearnost grafikona se prekida kroz koncentracija Neugasiva luminiscencija, samogasivi nivo intenziteta fluorescencije"> !}!}

Zatamnjenje luminescencije nastaje kada pobuđene molekule stupaju u interakciju s drugim, posebno paramagnetnim (dezintegrirajuća kiselina), koje stimuliraju procese interkombinacijske konverzije. Promjene temperature mijenjaju izlaz luminiscencije. Kao rezultat toga, povećava se učestalost isključenja, pri čemu dolazi do neproliferativne deaktivacije molekula koji se budi. Stoga se ispitivanje obično provodi na sobnoj temperaturi. Prisustvo vanjskog govora također smanjuje izlaz luminiscencije. Najaktivniji gasitelji luminiscencije su kationi i anjoni „važnih“ elemenata (I-, Br-, Cs+ i joni), paramagnetski joni i molekuli (Mn 2+, O 2 i joni), molekuli samoapsorbujućih - leži u glinenim dijelovima viprominyuvannogo svjetlosne lopte luminiscentnog govora 36

U skladu sa metodom 37, veliki broj fluorescentnih fluorescencija je okružen. Stagnaciona metoda za identifikaciju jedinjenja koja ispoljavaju luminescenciju vlage (semi-U(VI), posebno uranil - joni UO 2+, REE i jona) metalnih jona u obliku kompleksa sa organskim reagensima: 8-hidroksikinoli n koji yogo marširaju (preko 25 elemenata, t . dijelova Li, Ca, Mg, Ba, Sc, Al, In, Ga) oksiazot oksiazometinski spojevi (Al, Ga, Mg i in) polioksiflavoni (Zr, Hf, Sn, Th, Al, Be) rodamin žutika (Au, In, Ga, Hg, B, Te i dr.) organska jedinjenja - kondenzovani poliaromatični sistemi (antracen, fluoren, fluorescein)

38 kristalnih fosfora ili čvrstih materija. Pobrinite se da kombinuju glavnu supstancu (ZnS, CdS, CaS, SrS itd.) sa aktivatorom (Ag, Cu, Mn, Ce i dr.) i fluksom (NaCl, NaNO 3, KZ l, CaF 2 itd.) . U nekim slučajevima kristalni fosfor se može ukloniti kokristalizacijom aktivatora i glavne supstance iz infuzirane smjese ostatka. Spektar luminescencije kristalnog fosfora označen je tipom aktivatora Kristalni fosfor je označen hemijskim simbolima glavne supstance koja stabilizuje kristalnu strukturu aktivatora i fluksa. Na primjer, oznaka ZnS × Ag × NaCl znači da je kristalni fosfor cink sulfid, aktiviran sinter atomima, a tokom sinteze u njegovoj blizini, natrijum hlorid se topi

Na primjer, uranijum u količini od 10 -5 μg može se odrediti iz kristalnog fosfora na bazi NaF, antimona u količini od 10 -6 μg - na bazi CaO, rijetkih zemnih elemenata u količini od 10 -6 μg - na bazi ThO 2 Chu Toplina je izjednačena, a inode revolucioniraju atomske spektroskopske metode: selektivnost nije jako visoka 39

Značaj organskih istraživanja zasniva se na a) direktnim metodama fluorescencije i fosforescencije; b) efekat Špilskog; c) fosforescencija na sobnoj temperaturi. pri čemu su molekuli izolovani u jednom tipu i čvrsto fiksirani u kontejneru, usled čega su spektri niz uskih spektralnih linija i mogu jasno pokazati individualnost.

Fosforescencija organskih molekula je posljedica deaktivacije buđenja tripletnih stanja. Životni vijek triplet stanica je dug (do 100 s), pa je za sprječavanje fosforescencije potrebno molekulu u triplet stanici fiksirati u krutu matricu, odnosno imobilizirati. Za određivanje spektra fosforescencije najčešće se koriste organska jedinjenja koja kristališu na niskim temperaturama u kombinaciji sa: etil alkoholom - dimetilformamidom; etil alkohol - izopentan - dietil eter, koji kristališe u gustu masu na tački ključanja retkog azota 77 K 44

45 Za vibriranje fosforescencije na sobnoj temperaturi, fosfor je fiksiran na sorbentu obloženom solima Ag, Tl, Hg, bromida, jodida itd. (bitan efekat atoma) Sorbenti - filter papir, silicijum oksidi, selektivnost napreduje, jer je važan atomski efekat vrlo specifičan

Jasna analiza 46 Spektar luminiscencije je individualna karakteristika luminiscentne supstance. Spektri se mogu analizirati za analizu sjajne luminiscencije. Osigurajte da se takva analiza izvrši vizualno na osnovu boje mješavine. Kiselinska luminescentna analiza se koristi za praćenje minerala, vrsta stakla, vrsta ulja, itd. Vrlo osjetljive luminiscentne reakcije koje se mogu koristiti za identifikaciju jona c. Luminiscencija litijuma sa 8-hidroksihinolinom pojavljuje se u prisustvu 0,1 µg/ml Li, bakar pokazuje jarko plavu luminescenciju sa salicilalazinom u koncentraciji od 0,05 µg/ml itd.

Hemiluminiscentna analiza 47 Hemiluminiscentna vibracija se izbjegava kada se tokom hemijske reakcije stvori molekul koji je sposoban da luminescira nakon prelaska u glavni stupanj. buđenje stanja i zatim oslobađanje kvanta svjetlosti (indirektna ili senzibilizirana hemiluminiscencija) Da bi se izazvala hemiluminiscencija u vidljivom području spektra, potrebna je energija od 160 kJ/mol. Ovo je tipično za radikalne, Lanczugove i reakcije zasnovane na oksidaciji koje se odvijaju kroz mehanizam slobodnih radikala.

48 U praksi se reakcije oksidacije najčešće javljaju u nizu organskih jedinjenja, kao što su luminol (V), lofin (VI), lucigenin (VII) itd. Inhibirati hemiluminiscentnu reakciju promjenom intenziteta proporcionalno koncentraciji elemenata. Za analizu je potrebno smanjiti intenzitet luminescencije. hemijske reakcije, distribucija svjetlosti u spektru nije potrebna, odnosno nije potrebna

49 Metoda vikorističke hemiluminiscencije otkriva vrijednosti neorganskih i organskih tvari u rasponu do 10-8%. Razvijene su metode za identifikaciju metala platine, Fe, Co, Ni, Cu, Cr i drugih. sa PV do μg/ml, iako ove metode nemaju visoku selektivnost. . Reakcije NO + O 2 NO 2 * + O 2 NO 2 * NO 2 + hv su praćene luminiscencijom sa maksimumom na 800 nm.

Atomsko - fluorescentna spektroskopija 50 Atomsko - fluorescentna analiza je metoda elementarne analize spektra atomske fluorescencije. Fluorescenciju (obično rezonantnu) oslobađaju probuđeni atomi i bilježi se kako tok svjetlosti pomiče kvante energije, što ukazuje na aktivaciju prvog nivoa, atom koji kolabira prelazi u stanje buđenja, a zatim, kada se okrene, svjetlost će biti pušten sa dugim obrtom, što ukazuje na rezonantnu tranziciju. Ovaj proces se naziva i rezonantna fluorescencija

51 Šema aktivacije fluorescencije: a i b rezonantna fluorescencija sa različitih nivoa; c Stokesova fluorescencija je rezonantna; g rezonantna anti-Stokes fluorescencija; e kaskadna fluorescencija; faza aktivacije fluorescencije sa dva kvanta (ν 12 + ν 23)

52 U zavisnosti od broja fotona koji padnu na jedan akt aktivacije, mehanizam aktivacije može biti jednofotonski ili višefotonski postupno. nerezonantna fluorescencija (c – e) Nerezonantna fluorescencija se naziva Stokesova, ako se foton oslobađa manje od glinenog, a antiStoksova, ako se foton oslobađa, više od glinenog, jer je tranzicija pobuđena Uglavnom ću se fokusirati na putanju naknadnih prelaza, koji su praćeni oslobađanjem fotona, tada ovaj tip ima kaskadnu fluorescenciju (e) U stvarnim atomima broj elektronskih izvora energije je veći od tri. Za popunjavanje bilo kojeg od njih, postoji niz mogućnosti koje uključuju korak po korak i kaskadne prijelaze tokom konjunktivnih i viprominutalnih procesa. U pravilu, broj linija u spektru atomske fluorescencije ne prelazi deset.

53 Za atomizaciju rijetkih iskri (pražnjenja) možete koristiti bilo koju metodu polutalasne atomizacije, argonske visokofrekventne induktivno spregnute plazme ili elektrotermalne atomizere (električno grijanje strujom grafitnih cijevi, konca, klipera, lonaca) uzoraka nalik prahu izvodi se korištenjem elektrotermalnih inoda Na pola puta za dodatno zagrijavanje para uzorka, raspršivač se postavlja u atmosferu argona kako bi se povećao izlaz

55 Do uništenja atoma dolazi pod djelovanjem vanjskog mlaza, udio probuđenih atoma nije određen temperaturom raspršivača, kao u AEC-u, već intenzitetom njegovog mlaza Za velike atome, vrijednosti kvantnih prinosa U pravilu, ivice su male zbog visoke temperature jezgre, tako da u APS-u vikoristuyut usko dzherel viprominyuvannya buđenje fluorescencije vikorističke intenzivne lampe sa linearnim ili kontinuiranim spektrom (sijalice sa praznom katodom ili bez elektroda), kao kao i laseri sa dugim vijekom trajanja, koji preplavljuju ostatak vremena, APS metoda se razvija uključivo u laserske opcije - LAFS Upotreba lasera je omogućila naglo povećanje osjetljivosti metode.

56 Laseri ili optički kvantni generatori su trenutni uređaji za koherentnu vibraciju. Fizička osnova lasera je fenomen inducirane vibracije. , budući da je energija preostalog fotona nakon zamjene koherentna fotonu koji se naziva viprominuvanje (tj. „tačna kopija“); izuzetno visok nivo njegove monohromatnosti je nedostižan u promociji nelaserskih lasera Kao rezultat uskog, kooperativnog generisanja svetlosnih kvanta, bogatih atomima radnog govora, dolazi do povećanja svetlosti između frekvencija miliwatt naviše. do –10 13 W (u pulsnom načinu rada)

Helijum - neonski laser 58 U visokonaponskom električnom pražnjenju, nakon kontakta sa elektronima, deo atoma helijuma se prenosi u stanicu za buđenje. počinje lavinski proces umnožavanja identičnih koherentnih fotona. Ako se kiveta koja sadrži mešavinu gasova postavi između ogledala velike brzine, tada dolazi do generisanja lasera Laserski snop svetli u centru ne zbog snage laserskog snopa, već zbog električnog pražnjenja, koje generiše svetlost, slično kao u. Pored onoga što se vidi u neonskim lampama, Promin se projektuje na ekran desne ruke, izgledajući crvene mrlje koje sijaju

59 Analitički signal je vibracija u UV dijelu spektra, koju potiču pobuđeni atomi. Intenzitet atomske rezonantne fluorescencije je u prvom redu u najbližoj proporciji sa koncentracijom vibracijskih čestica: I 0 - intenzitet Uzbudljivo. svjetlosna aktivnost q - kvantna vrijednost fluorescencije prinosa k - koeficijent glinenja

60 Glavni nedostatak kod atomskih fluorescentnih elemenata je oscilatorna vibracija, koja je posljedica ruskog vyprominuvanja kao rezultat buđenja na atomima i molekulama analiziranog uzorka ruskog vipro. Analiza često maskira slabe signale rezonantne fluorescencije, tj. dužina analitičke linije se izbjegava velikom količinom raspršene svjetlosti kako bi se izbjeglo izobličenje. U vezi sa raznim vibracijama, za vikorizaciju se koriste linije nerezonantne fluorescencije, u kom slučaju se efekat buđenja može postići samo uz pomoć laseri

61 Za snimanje spektra fluorescencije, koristite spektrofotometre visoke svjetlosti sa visokim graničnim vrijednostima.

66

69 Linearna priroda spektra atomske fluorescencije osigurava visoku selektivnost za analizu atomske fluorescencije. Za ovaj atomizer je instaliran sličan broj spektrofotometara visokog intenziteta. AFS metodu je lako automatizovati, a varijabilnost opreme je izuzetno mala. sekcije), razna hemijska jedinjenja, za daljinsku identifikaciju elemenata u gornjim sferama atmosfere

Nivo identifikacije elemenata (ng/ml) metodama atomske spektroskopije Element AAS (polu) AAS (e/t) AES (polu) AES (PPT) AES (ISP) APS 5 1 0,01 0,04 0, 1 8 0,01 0,1 0,01 0,02 0,0002 0,01 2 0,5 0,3 0,2 0,01 0,003 0,1 0,8 0,4 0,6 0,5 0 ,09 0,9 0,4 0,2 0,001 0,8 70

Nivo identifikacije elemenata (ng/ml) metodama atomske spektroskopije Element AAS (pola) AAS (e/t) AES (pola) AES (PPT) AES (ISP) API Mg 0,1 0,02 0,02 0,9 0,1 0,8 0,0002 0,0005 0,0005 0,0005 0.004 0.05 0.03 0.2 0.007 0.05 0.001 0.2 .5 2 0.5 45 0.003 0, 01 0.04 0.2 2 0.1 0.2 10 1.5 0.1 0.0 .

Ovaj robot je zauzeo prvo mjesto u nominaciji "Najbolji opservacijski članak na takmičenju" - 2014.

Očigledno, samo jednom svjetloće biti uspješno ojačana po mraku. Pošto je tako mračno, još uvek moramo da se okrenemo. Za sada postoji samo nekoliko izgleda za sve koji su direktno povezani sa vakcinacijom Crna materijaі tamna energija. A os svjetlosti čovječanstvo već dugo uspješno koristi i vikorystvo, uključujući i kao posljednji „alat“. Jedan od direktnih izvora svjetlosti u eksperimentalnim istraživanjima veza sa fenomenom fluorescencija. U proteklih trideset godina, upotreba različitih metoda zasnovanih na detekciji fluorescencije brzo je rasla u biološkim i medicinskim istraživanjima. To je zbog pojave novih tehničkih mogućnosti – prije svega kompjutera i lasera – i širokog spektra dostupnih fluorescentnih molekula i molekularnih kompleksa. Inače mikroskopski reporteri Oni nas posebnim svjetlosnim signalima obavještavaju o snazi ​​molekularne svjetlosti, a smrad se nastavlja. Fluorescentna metodologija pružila je mnoštvo važnih istraživanja u biologiji i medicini. Zbog visoke osjetljivosti i stepena nepažnje, postoji mnogo tradicionalnih metoda povezanih sa očvršćavanjem radioaktivnih tvari. Metode fluorescentne analize koriste se kako u fundamentalnim istraživanjima za sticanje novih saznanja o živim bićima, tako i u primijenjenoj robotici u biotehnologiji, medicinskoj dijagnostici, kriminologiji i nizu drugih područja. Šta su fluorescentni reporteri? Koje informacije se mogu izvući iz njihove pomoći iz dubina mikrosvijeta? Kako se ove informacije bilježe i analiziraju? Pred nama - šta je fluorescencija?

Fluorescencija: svjetlo indukovano svjetlo

Počinju dani govora nakon bljeskanja svjetla u pjevalištu Dovzhin Khvil promovirati svjetlost u drugačijem, većem rasponu svjetlosti. Prije svega, ovaj fenomen je opisan kao vidljiva promjena boje raznih organskih spojeva i minerala kada se pazi da ne prođe kroz svjetlost (na svjetlost koja prolazi), već pod svjetlo da prođe. Tako je, na primjer, Sir David Brewster 1833. godine primijetio da kada se posvijetli bijelom svjetlošću, zeleni alkohol rastvara hlorofil u crvenom svjetlu. Kasnije, 1845., John Herschel (Sir John Herschel) je opisao slična upozorenja - pojavu zaražene fermentacije u ne-barbarskom rastvoru kinin sulfata kada se ubrizgava sa sojinim svetlom. Rođen 1852., George Gabriel Stokes vidljivo na oko svetskog minerala fluorit kada ste uznemireni nevidljiv izlaganje ultraljubičastom zračenju. Doktori su pazili na svijeću, na koju su pazili, nazivajući ovu pojavu fluor escencija, kako to podrazumijevamo po analogiji sa pojmom opal suštinu koja opisuje fenomen dihroizam u sramoti. Važno je da ovi pojmovi odražavaju „istoriju“ vašeg putovanja, ali, što je još važnije, označavaju različite fizičke pojave. Fluorescencija- tse viprominyuvannya, koji se pojavljuje u molekulima govora pod dotokom svjetlosti. Opalescencija - ovo rozsiyuvannya Svetla, koja su praćena smetnjama.

Zbog svoje suštine, fluorescencija je jedna od varijanti luminescencija. Ovaj termin opisuje sve manifestacije proizvodnje govora uzrokovane „buđenjem“ molekula različitim faktorima. Tako, na primjer, u određenim kemijskim reakcijama hemi luminescencija. Hemiluminiscencija u biološkim objektima se naziva bio luminiscencija*. Govori o tome kako zadržati svjetlo upaljeno kada vas probudi strujni udar ( električni luminiscencija), tečni elektroni ( katoda luminiscencija), γ-viprominuvanje ( radio luminiscencija) i drugi. U kom kontekstu fluorescencija pripada ovoj kategoriji? fotografija luminescencija.

* - Nedavno je objavljen čudesan članak o "biomolekuli", koji opisuje razvoj nove vrste bioluminiscencije: « » . – Ed.

Ovi fluorescentni atomi, molekuli i molekularni kompleksi se nazivaju fluorofori ili drugo fluorohromi. Pobrinite se da ovi pojmovi budu zamijenjeni sinonimima. Međutim, u velikom broju ćelija ispod fluorohroma nalaze se sve vrste fluorescentnih molekula, a ispod fluorofora - samo fluorescentna komponenta (grupiranje) velike molekule. Klasična monografija J.R. Lakovitsa sadrži samo jedan termin - fluorofor, za sve vrste fluorescentnih supstanci. Na isti način, koristi se ovaj izraz. Takođe je značajno da je u dosadašnjoj praksi kovalentnog vezivanja fluorescentne komponente na makromolekulu uobičajeno da se zove fluorescentna etiketa i slobodni fluorofor - sonda. Fluorofori koji se koriste u mikroskopiji nazivaju se fluorescentne školjke. Konačno, autori su počeli da vikoriziraju termin biosenzori Pored fluorofora koji se koriste u biološkim istraživanjima.

Fizička priroda fluorescencije može se lako ilustrovati crtanjem dijagrama, kako je to predložio poljski fizičar Oleksandr Yablonsky 1933. godine, a u njegovo ime. Beba 1 je predstavljena u pojednostavljenom obliku sa dijagramima.

Malyunok 1. Dijagram Jablonske, koji ilustruje elektronske procese u molekulima fluorofora sa apsorbovanim kvantima svetlosti Horizontalne linije- energetski nivoi elektrona: S 0- glavni kamp za buđenje; S 1- Jednogodišnji kamp buđenja; 0–3 - kvantizovana antička istorija; T 1, T 2- kvantizirano jednako probuđenom stanju tripleta. Strelice pokazuju prelaze elektrona u različitim izvorima energije: P- glineno svjetlo, Fl, Phosph- vibrirajuća fluorescencija i fosforescencija, očigledno, VC- interna konverzija, ÍČ- interkombinacija konverzije, VR- Vibraciona relaksacija.

Na cigentnom fotonu, pjevanje molekula fluoroforus je rekhíd Elektroniv z “glavni” (s 0) jer će jedan íz “zbujeng” (s 1, s 2, ..., s n) postati Vishchoyo Yenergíyu. Spin elektrona se ne menja tokom tranzicije, zbog čega se elektroni nazivaju singlet. Stanje „buđenja“ je nestabilno, a elektronika se brzo okreće na nivo izlazne energije. Možete se uključiti na što više puteva. Tri od njih su nepromotivne kvantne tranzicije: interna konverzija, interkombinacija konverzijeі opuštanje vibracijama. Ostala dva prate različita rasvjetna tijela - ovo fluorescencijaі fosforescencija. Sa unutrašnjom konverzijom, energija elektrona se mijenja na minimalni singlet nivo. Tokom vibracijske relaksacije, koja je uzrokovana prvenstveno interakcijom sa dodatnim molekulima, apsorbirana energija se može “raspršiti” u obliku topline do “osnovnog” nivoa. Interkombinovana konverzija dovodi do promjene energije elektrona zbog promjene spina. Takvo energetsko stanje elektrona naziva se trogodišnjim. Fluorescencija se povećava tokom prelaska sa nižeg singletnog nivoa na “glavni” nivo, a fosforescencija - tokom prelaska na “glavni” nivo sa tripletnog nivoa.

Tri važne okolnosti su značajne.

• Prije svega, važnost važnih tranzicija varira. Detekcija ovoga daje isto vrijeme dok se koža razvija iz ovih prijelaza, inače se čini da je to sat prijenosa elektrona u koži iz ovih prijelaza (Tablica 1). Kada prođe manje od sat vremena, vrijeme je za ovu tranziciju. Možete vidjeti da su fluorescencija i, što je još važnije, fosforescencija procesi male snage. Ovo se manifestuje u relativno slabom intenzitetu svetlosti fluorofora nakon intenzivnog intenziteta.
• Na drugi način, fragmenti fluorescencije mogu nastati tokom prijelaza elektrona u „osnovno“ stanje samo sa najnižeg singletnog nivoa, tada je prenesena energija manja od izgubljene energije. Stoga će fluorescentni spektar fluorofora sada biti bliže usklađen sa spektrom gline.
• Ja ću, treće, odrediti stanje elektrona koji su prisutni u ovim procesima, kako od fizičkih službenika Dovkilla, tako i od podzemne elektronske promjene molekula. Istu postavku koristite i fluorohrom. molekularni reporter, koji „mojom“ fluorescencijom informiše o fizičkim i hemijskim umovima svog ekstremiteta.

"Mova" fluorescentnih reportera

Fluorescenciju karakterišu niski parametri, koji variraju u zavisnosti od fizičkog izoštravanja i hemijske modifikacije fluorofora. Ovi parametri su „rudski“ koji prenose informacije sa fluorescentnog reportera. Ako nastavimo analogiju, onda se čini da sami parametri sugeriraju određeno mjesto samo za svoje kombinacije iu kontekstu. "Kontekst" za parametre fluorescencije i njihovu registraciju. Fluorescencija svih fluorofora ima pet ključnih karakteristika: sjaj i spektre fluorescencije, kao i kvantni prinos, životni vijek i anizotropiju fluorescencije.

Kožni fluorofor je individualan spektri gline i fluorescencije . Za ilustraciju bebe 2, predstavljen je spektar Lyso Tracker TM Blue (Molecular Probes®) i fluoresceina. Glavni parametri spektra su intenzitet fluorescencije, razvoj maksimuma i tzv. puna širina (širina spektra je jednaka polovini maksimuma). Često upravo ovi parametri na precizan način „informišu“ o pesmama vlasti gde se reporter nalazi. Dakle, spektar fluorescencije mnogih fluorohroma pokazuje karakteristične promjene zbog različitih pH vrijednosti. pH vrijednost spektra fluorescencije Lyso Sensor TM Yellow/Blue (Molecular Probes®) prikazana je na bebi 2 kao guza. Zato što su oni tako specifični. može uticati samo na pH, onda fluorofor može biti pH reporter. Lyso Sensor TM Yellow/Blue je jedan od takvih reportera.

Kvantni prinos fluorescencije - ovo je karakteristika efikasnosti u kojoj se apsorbovana energija transformiše kao odgovor na procese nepromotivne relaksacije. Tačan kvantni prinos izračunava se kao omjer broja osvijetljenih fotona i izumrlih fotona. Što je veći kvantni prinos, veći je intenzitet fluorofora. Često je ovaj indikator najvažniji pri odabiru fluorofora koji će igrati ulogu fluorescentnog reportera. Na primjer, fluorescein ima kvantni prinos od približno 0,9, što osigurava širok spektar primjena i kao samostalna sonda i kao fluorescentna oznaka za nefluorescentne molekule. Također je važno da je ovaj indikator vrlo osjetljiv na različite fizičke i hemijske interakcije reportera.

Sat u životu fluorescencije - tokom perioda usrednjavanja, tokom kojeg molekuli fluorofora ostaju u probuđenom stanju pre nego što se otpuste fluorescentni fotoni. Ovaj indikator pokazuje da se fluorescencija gasi nakon kratkog buđenja. Sat u životu fluorescencije, s jedne strane, čak i „osetljiv“ na fizičku i hemijsku „situaciju“, je fluorescentni reporter. S druge strane, ovaj pokazatelj je specifična karakteristika fluorofora, što omogućava razlikovanje “izvještaja” od prisustva drugih fluorescentnih molekula sa sličnim spektralnim karakteristikama.

Fluorescentna anizotropija - ovo je jaka karakteristika intenziteta polarizacije fluorescencije u odnosu na polarizaciju ekscitacijske svjetlosti. Na osnovu anizotropije moguće je dobiti informacije o opštoj fluidnosti reportera i o viskoznosti medija u njegovom mikrookruženju.

Pet značenja parametara fluorescencije direktno je povezano sa karakteristikama istaknutosti koju reporteri „prenose“. Prote, informativne mogućnosti fluorescentnih reportera nisu ograničene. Brojne su stvari povezane s fluorescencijom koje se koriste kao metodički "trikovi" za presretanje ovih i drugih informacija od fluorescentnih reportera.

Tako, na primjer, postoji jasan fenomen neprominentnog (rezonantnog) prijenosa energije (BTE) s jednog fluorofora na drugi. U ovom slučaju, intenzitet fluorescencije donora energije se mijenja, a akceptor se povećava. Možete razlikovati fluorofore i jake spektralne utjecaje, što je posebno važno jer se nalaze u neposrednoj blizini. BPE je osnova raznih metodoloških pristupa koji omogućavaju otkrivanje interakcija molekula. Povećana efikasnost neupadljivog prijenosa energije omogućava procjenu interakcije između molekula. Veza sa BPE inodama naziva se "molekularna linija" (razd.: « » ).

Brojne metodičke mogućnosti su zasnovane na ekstinkcionoj fluorescenciji. Gašenje može biti uzrokovano fizičkom interakcijom fluorofora s molekulama za gašenje - kao što su kiselina, halogeni, amini, kao i neki organski molekuli s nedostatkom elektrona. I tu fluorescentni reporter može „prijaviti“ prisustvo „aparata za gašenje“ u njegovoj ćeliji.

Fluorofor se također može ugasiti fotoekspozicijom pod injekcijom visokog intenziteta. Najčešće se čini da je registracija fluorescencije negativna pojava. Međutim, „u sposobnim rukama“ ovo se čini kao posebna metodička tehnika. Široka ekspanzija ranjenog viskoziteta i/ili difuzione moći citoplazme ćelija otkrila je tehniku ​​obnavljanja fluorescencije fluorofora nakon fotolize. Suština ovoga leži u činjenici da se na malom prostoru laboratorije, radi postavljanja fluorofora, tretman provodi kratkotrajnim, intenzivnim laserskim snopom. Zatim se bilježi obnovljena fluorescencija istog intenziteta, koju uzrokuju difuzni fluoroforni molekuli iz drugih područja tkiva. Dinamiku ovog procesa karakterizira difuzijska moć citoplazme.

Fluorescentni reporteri, šta oni smrde?

Potencijal fluoresciranja nazire se u mnogim riječima s različitim konfiguracijama elektrona. Takve promjene se dešavaju u mnogim atomima, molekulima i supramolekularnim kompleksima. Polazeći od potrebnih specijalnih istraživanja, potencijalni “signalitet” fluorofora igra ulogu molekularnog reportera za biološka i medicinska istraživanja. “Valjanost” se ocjenjuje zbog specifičnosti informacija koje prenose, njihove stabilnosti, prije fotostabilnosti, u nizu epizoda postoji toksičnost za određene ćelije ili organe zmu. Posebnost fluorescentnih “dopisnika” je njihova visoka individualna “specijalizacija”. „Specijalizaciju“ reportera kože karakteriše interakcija sa glavnim komponentama biološkog sistema, kao i specifičnost fluorescentnih signala. Mentalno možete vidjeti dvije grupe novinara stvorene na osnovu organskiі neorganski fluorofori.

Organski fluoroforni molekuli predstavljaju najveću i najraznovrsniju grupu fluorescentnih reportera. Koliko je velika ova raznolikost može se procijeniti ako pogledate katalog Molecular Probes, koji se specijalizirao za razvoj i proizvodnju fluorofora od 1975. godine. Ovo je već jedanaesto (ažurirano) izdanje kataloga (u vrijeme pisanja ovog članka), što potvrđuje visoku stopu razvoja ovog galusa.

Velika raznolikost organskih fluorescentnih reportera je rezultat širokog spektra njihovih zadataka i umova. Prilikom odabira ili razvoja reportera, pažnja se poklanja informacijama koje treba ukloniti, spektralnoj snazi ​​fluorofora, kao i posebnim razmatranjima vezanim za karakteristike sistema za praćenje. To je ilustrovano primjenom fluoresceina i sličnih (slika 4). Kao što je navedeno, ovaj fluorofor ima visok kvantni prinos i, očigledno, blistavu fluorescenciju. Može igrati ulogu pH reportera. Međutim, na primjer, nije pogodan za vibriranje pH u sredini ćelija. ne prodire u citoplazmatsku membranu. Njegova "isporuka" ćelijama može se postići upotrebom hidrofobne supstance - fluorescein diacetata, koji, izgubivši sposobnost fluorescencije, može prodrijeti kroz hidrofobnu barijeru citoplazmatske membrane. U ćelijama esteraze sadrže acetilne grupe, a fluorescein se detektuje u ćelijama. Diklorofluorescein se isporučuje na sličan način. preko esterifikovane Pohidne. Ovaj reporter služi da registruje prisustvo aktivnih oblika kiseline u ćelijama. Uvođenje izotiocijanata u molekul fluoresceina omogućava dodavanje fluorohroma amino grupama nefluorescentnih molekula. Visoko specifični fluorescentni proteinski reporteri - različita antitijela, streptavidin (reagens za biotin), kao i nukleotidi i oligonukleotidi - stvoreni su korištenjem zamjenskog fluorescein izotiocijanata. Nareshti, 5-karboksimetoksi-2-nitrobenzil estar fluoresceina (nije prikazan na slici 4) nije fluorescentan, ali se može pretvoriti u primarni fluorescein kada je izložen svjetlosti 355 nm. Ovo je zadnjica fotoaktiviranih fluorofora, fluorescentne snage neke vrste koji su "u kavezu" dok se ne oslobode.

Malyunok 4. Strukturne formule fluoresceina i drugih sličnih.

Sedamdesetih godina dvadesetog veka, diplomirani student Univerziteta Princeton (SAD) Osamu Shimomura ( Osamu Shimomura) za bioluminiscenciju meduza Aequorea victoria Videvši dva proteina, šta se dešava u ovom procesu. Utvrđeno je da pri interakciji jona kalcijuma sa jednim od proteina dolazi do hemiluminiscencije crne boje. U tom slučaju, drugi protein može biti potamnjen tamnom svijetlom bojom i fluorescirati zelenim svjetlom, što daje zelenu nijansu svijetloj meduzi. Prvi protein je nazvan aequorin, drugi zeleni fluorescentni protein (GFP). Od ovog trenutka počinje priča o jednom od najuspješnijih razvoja molekularne biologije, a njegovi glavni likovi su Osamu Shimomura, Martin Chalfie ( Martin Chalfie) da Roger Tsien ( Roger Tsien) Grupa je 2008. godine dobila Nobelovu nagradu za galuzijsku hemiju za svoj razvoj i detaljan razvoj ZFB-a. Šta je ovo čudesni protein?

Nakon otkrića ZFB-a, počela su intenzivna istraživanja njegove strukture, te je sintetiziran i kloniran gen sličan Yomi. Štoviše, među aktivnim morskim bićima bez bodlji ( Hydrozoaі Anthozoa) Identifikovani su slični fluorescentni proteini čija je struktura takođe okarakterisana. Sve je to omogućilo da se uz pomoć dodatnih metoda molekularne biologije direktno konstruišu geni koji kodiraju modifikovane forme ZFB sa širokim spektrom spektralnih karakteristika, kao i fotoregulisanim opcijama, od kojih se razne mogu „uključiti i isključiti“. ” dom je izložen ultraljubičastom zračenju. U ovom trenutku možemo govoriti o tome da je na bazi ZFB-a stvorena i nastavlja da raste čitava armija različitih fluorescentnih proteina (FP). Mogućnost stagnacije FB pokazala se u studijama mnogih tipova ćelija od bakterija do stagnirajućih.

Još “skromnije” je uklonjeno sa ZSE dok se pojavljuje “udio” equorina. Ova struktura je također umetnuta i sintetizirana u DNK koja kodira ovaj protein. Proučavanje prisustva hemiluminiscencije u equorin i jonima kalcija omogućilo je razvoj metoda za vibriranje koncentracije kationa u određenim stanicama. Za vibriranje umjesto jona kalcijuma u sredini ćelija, koriste se fluorescentni reporteri, uključujući slučajni FB. Međutim, prednost hemiluminiscentne metode sa vikorinom je potreba za ispitivanjem, što uzrokuje fluorescenciju, koja nije uvijek štetna za biološki sistem, te za fluorofore, čija svjetlost slabi kada je izložena trivalu (efekat fotosunčanja). Equorin je uključen u prilično veliku grupu luciferina - spojeva odgovornih za bio(hemi)luminiscenciju u mnogim morskim i kopnenim organizmima. Proučavanje luciferina je od interesa ne samo zbog praktične primjene. Iako još uvijek ne znamo, biološkim objektima će na kraju trebati bioluminiscencija.

Još uvijek postoji značajan interes za razvoj fluorescentnih reportera zasnovanih na neorganski fluorofora načinom oblikovanja tzv biokonjugati, tobto. Njihovi kompleksi sa različitim organskim jedinjenjima i/ili biološkim molekulima. Puno atoma, na primjer, prijelazni metali, lantanidi (tačnije, njihovi ioni, na primjer, Tb 3+ i Eu 3), klasteri mnogih atoma zlata i srebra nakon stvaranja takvih kompleksa razvijaju se dok se senzibilizirani fluorescencija. Suština fenomena leži u činjenici da se energija svjetlosti, glinovita organskom polučvrstom tvari, prenosi na atom neorganskog elementa, koji proizvodi fluorescenciju. Važan uticaj u ovom procesu je da ih molekule koje daju energiju prenose u obliku elektrona koji su prisutni u tripletnom stanju. Zato je vredno pomena neorganski fluorofori u takvom kompleksu su “povećani” i izjednačeni sa “primarnom” fluorescencijom, budući da je životni vijek elektrona u tripletnom stupnju znatno duži nego u singletnom (div. Tabela 1). Osim toga, spektri fluorescencije neorganskih biokonjugata su male širine i jako poremećeni u poređenju sa spektrima gline. Fluorescencija biokonjugativnih reportera je senzibilizirana za rad s njima sa stanovišta tehnike snimanja i prominencije. Dakle, smrad će se pojaviti u glavama, ako se sistem prati do „primarne“ fluorescencije drugih komponenti u istom opsegu dovžin hvil.

Posebno mjesto u ovoj grupi zauzimaju biokonjugatni reporteri, u kojima su kristali provodnika veličine 2-10 nm (nanokristali) zasićeni fluoroforom, tzv. kvantne tačke* (engleski) kvantne tačke). Kvantne tačke se obično sastoje od parova III/V elemenata (na primjer, CdS, CdSe, ZnS) ili II/VI grupa (na primjer, GaN, InP, InAs). Zbog male veličine kristala provodnika (sadrže samo 10-50 atoma!), njihovi elektroni stvaraju umove kvantiziranih energetskih prijelaza, sličnih onima koji se javljaju u drugim atomima. (Kvantne tačke se takođe nazivaju "komad atomi"). Štaviše, energija ovih prelaza, kao i povećanje fluorescencije, leži unutar veličine kristala. Što je manje kristalno, to je više upisana energija istaknutosti. manje fluorescencije (slika 5). Ova snaga otkriva mogućnost stvaranja kvantnih tačaka koje mogu imati gotovo bilo koju spektralnu konfiguraciju. Do ove tačke, u poređenju sa organskim fluoroforima, može postojati još veći kvantni prinos i fotostabilnost. Na sl. 6 prikazuje različite veličine različitih reporterskih fluorofora.

* - Koga je ovo ime zadirkivalo, pročitajte izvještaj « » . – Ed.

Malyunok 5. Fluorescencija klastera kvantnih tačaka različitih veličina.

Biokonjugati na bazi kvantnih tačaka sastoje se od jezgre (na primjer, CdSe), presvučene kuglicom od materijala provodnika (na primjer, ZnS), koja ima funkciju "sušenja", i liganda - organske tvari koja osigurava uništenje tamo nije dodatak bioloških molekula.

Malyunok 6. Specifične dimenzije fluorescentnih reportera su takođe prikazane za poravnanje, protein imunoglobulin G (Ig G).

Bioorganska ljuska biokonjugata osigurava njegovu stabilnost kao koloidne čestice i čini “zadatak” reportera, čija je svrha: gdje komunicirati, kako “prikupiti i prenijeti” informacije. U ovom slučaju, dimenzije reportera baziranog na kvantnoj tački mogu se značajno povećati (slika 6 prikazuje približne dimenzije kvantnih tačaka bez izobličenja biokonjugata). Bioorganska ljuska može sadržavati molekule niske molekularne težine kao što je biotin i fragmente DNK visoke molekularne težine (oligonukleotidi) i proteine, uključujući enzime i antitijela (Ig G).

Alati za čitanje fluorescentnih izvještaja

Naše oko je kroz istoriju bilo na vrhu liste alata za otkrivanje i analizu fluorescentnih reportera. Uz ovu pomoć možete vršiti vizuelni nadzor fluorescentnog svjetla na makroskopskim objektima direktno, ali i na mikroskopskim - uz pomoć fluorescentnog (luminiscentnog) mikroskopa. Korištenje makroskopskih objekata mogu biti kolonije mikroorganizama, kao što su ekspresija PB, hromatogrami i elektroforegrafi iz skrućivanja fluorescentnih žutika. A u "primarnom" fluorescentnom mikroskopu (o "neprimarnim" mikroskopima malo dalje) najčešće traže da identifikuju imunološke reakcije iz zamjenskog obilježavanja antitijela fluoroforima, kao i iz različitih studija o tome da postoji mnogo usamljenih klijenti. Međutim, mogućnost vizualne analize je općenito ograničena jasno procjena “signala” fluorescentnih reportera: “nema sjaja – nema sjaja” u pjesmi galusa. Mnogo više informacija može se prikupiti "čitanjem i dešifriranjem" fluorescentnih "izvještaja" Kilkisnim karakteristike svjetla (razd "Mova" fluorescentnih reportera).

Za dobru karakterizaciju fluorescencije potrebno je koristiti razne posebne uređaje i specifičnu metodologiju. Intelektualno se mogu vidjeti dvije metodologije za podešavanje parametara fluorescencije. Prvi korak služi za harmonizaciju različitih karakteristika fluorescencije na prilično velikom (makroskopskom) području objekta, čime se osigurava razdvajanje integralnih ( prosjek) fluorescentne karakteristike objekta: zrno, suspenzija zrnastih čestica, ćelije, podćelijske čestice itd. Druga metodologija se fokusira na izumiranje na istom nivou pojedinačni mikroskopski objekti- na prvom mjestu su ćelije i subklinitne čestice.

Zatamnjenje integralne fluorescencije vrši se uz pomoć dodatnih spektrofluorimetara (fluorescentnih spektrofotometara) i tabletnih fluorimetara ( engleski. čitači ploča). Spektrofluorimetrija je, po pravilu, analitički uređaj na kojem se mogu odrediti sve glavne karakteristike fluorescencije. Tabletni fluorimetri su uređaji dizajnirani za masovnu analizu velikog broja uzoraka (standardne tablete su dizajnirane za 96, 384 i 1536 uzoraka). Njihova varijacija ovisi o određenim fiksnim karakteristikama - na primjer, o intenzitetu fluorescencije u prvom spektralnom području. Nedavno su se pojavili tabletni fluorimetri sa mogućnošću variranja parametara raspada fluorescencije i na taj način procjene vijeka trajanja fluorofora u stanju pod naponom. Većina metoda koje koriste tabletne fluorimetre zasnivaju se na imunološkim reakcijama ili na analizi razvoja ćelinskih kultura u monosferama.

Metodologija za simulacije fluorescencije pojedinačnih mikroskopskih objekata također ima dvije opcije. Prva osnova na snimljenim digitalnim slikama fluorescentnih mikroobjekata ( engleski. fluorescentno snimanje) sa daljom kompjuterskom analizom ( engleski. kompjuterska analiza slike). Drugi je na "komad po komad" svijetu fluorescencije mikroobjekata u protoku pri prolasku kroz usku kapilaru posebnog uređaja - protočnog citometra ( engleski. protočni citometar).

Digitalne slike fluorescentnih mikroobjekata proizvode se pomoću napredne fluorescentne mikroskopije, koja je nedavno doživjela veliku tehničku revoluciju. Tako su, pored standardnih fluorescentnih mikroskopa, uz sofisticirane digitalne kamere i kompjutere, razvijeni fundamentalno novi uređaji. Oni se nazivaju konfokalni mikroskopi (slika 8). U konfokalnom mikroskopu, fluorescentno snimanje se generiše i snima kroz mikroskopski otvor, koji detektuje „prijem“ svetlosti, što je određeno fokusom sočiva. Način skeniranja „optičkim okom“ u horizontalnoj i/ili vertikalnoj ravni, snimanja signala fotoumnožavanjem i kompjuterskom obradom je da se dobije prostor slike fluorescentnog objekta. Ovaj dizajn nam omogućava da snimamo jasnije slike u poređenju sa standardnim dvo- i trodimenzionalnim mikroskopima. Osim toga, trenutni konfokalni mikroskopi mogu se koristiti za simulaciju parametara gašenja fluorescencije.

Malyunok 7. Konfokalni mikroskop.

Druga vrsta "revolucionarne" mikroskopije djeluje izvan osnovnih fizičkih principa fluorescencije. Uništenje atoma u njima izgleda kao svjetlost iz prošlog stoljeća. više poslednji vek fluorescencije... (razd. sekcija Fluorescencija: svjetlo indukovano svjetlo). U stvari, osnovni zakoni fizike se ne krše korištenjem ovih mikroskopa. Samo sa dovoljnim intenzitetom svetlosnog toka, dva fotona mogu istovremeno da "protrate" dva fotona, energija koju apsorbuju elektroni će se uskladiti, a čini se da je í̈ dovoljan da pokrene fluorescenciju. Zato se ovi mikroskopi i zovu dvofotonski. Trenutačni "udar" dva fotona u jedan atom je manje vjerojatan i može se naći samo tamo, gdje postoji svjetlosni tok maksimalne koncentracije. u fokusnoj tački sočiva. Ovo će osigurati visok nivo jasnoće fluorescentnih slika. Prednost koju su povećali dvofotonski prikazi drugih mikroskopa je njihova sposobnost snimanja fluorescencije na slikama na dubinama do 1,5 mm (sa informacijama o prodiranju do velikih dubina), kao i mogućnost efikasnog mijenjanja neugodnog efekta mikroskopa. izazivanje povratnih informacija o objektima Ono što se istražuje su fluorescentni reporteri.

Posebne analitičke tehnike (tzv. fluorescentna korelaciona spektroskopija) omogućavaju vikorističkom konfokalnom i dvofotonskom mikroskopijom da se prati prisustvo pojedinačnih (!) fluorescentnih molekula.

Međutim, "na vrhu" moderne optičke mikroskopije, iza posebnog dijela, nalaze se takozvani "nanoskopi", mikroskopi koji vam omogućavaju da vidite objekte na slici koji fluoresciraju, stoje između njih lka nanometara. Postoje dvije vrste takvih uređaja. Prva osnova na skeniranoj slici bila je korištenje uskih laserskih zraka. Njihova optička snaga je odabrana tako da jedan izaziva fluorescenciju u “potrebnom” području, a drugi ga potiskuje u “nepotrebnom” području, koje je zadato. Veličina "potrebne" površine može biti blizu nekoliko nanometara. Ova metoda je nazvana STED mikroskopija.

Princip rada drugog tipa nanoskopa krije mogućnost optičkog "uključivanja i isključivanja" fluorescencije nekoliko fluorofora. Snimite slike istog simbola nekoliko puta, uključujući jedan ili drugi molekul. Zatim kompjuter preklapa slike jednu na jednu, a na zbirnoj slici možete vidjeti svjetlost kože i susjednih molekula. U "primarnom", neka se kaže, i konfokalnom mikroskopu, smrad bi bio ljut na jedan plamen koji bi usijao. Ovaj pristup je nazvan PALM mikroskopija.

Fluorescentni “izvještaji” registrovani u obliku digitalnih slika se “dešifriraju” kako bi se ove informacije izdvojile korištenjem posebnih programa za analizu slike. Tako je moguće izmeriti intenzitet fluorescencije i prostornu distribuciju, proceniti spektralne karakteristike vibracija (pseudospektralna analiza), odrediti broj fluorescentnih čestica (na primer klitin), okarakterisati i polarizacione parametre fluorescencije.

Također je važno napomenuti estetsku informativnu vrijednost fluorescentne mikroskopije. Fluorescentni reporteri na mikrofotografijama otkrivaju nam očaravajuću svjetlost himerične kombinacije boja i oblika (zasljepljujuća slika 8). Proizvođači mikroskopa Nikon i Olympus često održavaju opsežna takmičenja foto identikita o mikrosvjetlu sa svjetlosnom fluorescencijom. Galerije robota koji se takmiče u ovim takmičenjima mogu se pronaći na web stranicama Olympus BioScapes i Nikon Small World.

Malyunok 8. Fluorescentne mikrofotografije iz galerije takmičenja Nikon Small World. 1. Fibroblasti miša. 2. Copepod Temora longicornis. 3. Mitoza u ćelijama je slična kao kod tritona. 4. Ćelije velikog mozga miša in vivo(Dvofotonska fluorescentna mikroskopija).

Za razliku od fluorescentnih mikroskopa, protočni citometri nemaju sposobnost detekcije fluorescentnih objekata. U pravilu su to suspenzije stanica koje sadrže fluorofore. Snaga protočnih citometara je fleksibilnost snimanja signala sa pojedinačnih objekata. Prvi komercijalno dostupan citometar omogućava vam da prigušite fluorescentne signale iz ćelija brzinom od 1000 ćelija u sekundi, a specijalizovane visokoproduktivne - do 25 000 ćelija u sekundi! Standardna verzija robota prenosi živost kožnog predmeta od dva do deset parametara: svjetlost i fluorescenciju jednog ili više fluorofora. Proučavanje velikog niza objekata omogućava da se dobiju statistički pouzdani rezultati zbog heterogenosti staničnih, bakterijskih i mikrobnih populacija.

U seriji standardnih protočnih citometara postoje uređaji koji mogu fizički odvojiti (sortirati) ćelije prema sljedećim parametrima: rasipanje svjetlosti ili fluorescencija. Ovo pokazuje mogućnost daljeg razvoja mladih subpopulacija od neuspjeha drugih metoda.

O čemu vam govore fluorescentni novinari?

Kao što je već rečeno (div. podijeljeno Fluorescentni reporteri), onda svi fluorescentni reporteri imaju specijalizaciju. Sadašnji izbor karakteriše pesme moći biološkog sistema. Razgovarajmo ukratko o ovim kategorijama "fakhivita".

Za dodatnu pomoć s reporterima s niskim fluorescentnim svjetlom, možete pratiti enzimska kataliza. U pravilu su to organski fluorofori. Tako se, na primjer, stvaraju supstrati sa kovalentno vezanim fluoroforima, koji počinju fluorescirati tek nakon što se oslobode tokom reakcije. Ovo je ujedno i „informacija“ o prekidu enzimske katalize. Druga metoda je korištenje "profluorofora", koji postaje fluorescentan kao rezultat interakcije sa produktom reakcije. Uz pomoć fluorescentnih reportera enzimskih reakcija prati se dinamika procesa, kao i njihova lokalizacija u ćelijama, tkivima, organima itd.

Reporteri, formirani na bazi antitela, obaveštavaju o napretku Imunološke reakcije. Miriše na fizičke komplekse ili kovalentna jedinjenja fluorofora sa antitelima (imunoglobulinima). Kao fluorescentna komponenta, prikazana je održivost svih poznatih organskih i neorganskih fluorofora, uključujući kvantne tačke. Osim toga, enzimi se mogu dodati antitijelima da kataliziraju reakcije u fluorescentnom proizvodu. Uz pomoć imunoloških fluorescentnih reportera otkriva se prisustvo antigenskih proteina u uzorcima, kao i njihova lokalizacija. Tako je, na primjer, dokaz za bebu 8 (fotografija 1) mikrofibrila u fibroblastima miševa otkriven uz pomoć fluorescentnih antitijela.

Možete dobiti mnogo vrsta informacija sa Facebook wikija. Razvijena je metoda za stvaranje hibridnih proteinskih gena za zamjenu PB kao fluorescentne oznake bilo kojeg prirodnog proteina ili za prijenos nukleinskih kiselina. Uvođenje gena takvih "hibrida" u ćelije omogućava dodeljivanje "adresa" fluorescenciji lokalizacija molekularnih komponenti živih ćelija, prate dinamiku njihove sinteze i pomjeranja. Glavni pH nivo fluorescencije je prisustvo hibridnih proteina na koje se testira sublimacija unutrašnjeg ćelijskog pH. Prednost ovakvih pH reportera u poređenju sa drugim organskim fluoroforima osetljivim na pH je sposobnost da vibriraju pH u sredini različitih unutrašnjih ćelija (organela), gde je „adresirana“ glavna komponenta „hibrida“.

Od posebnog interesa je stagnacija različitih FB u kombinaciji sa tehnikama fluorescentne vibracije zasnovane na BPE. Za vakcinaciju interakcija i ko-lokalizacija U ćelijama, bilo koja dva proteina prethode dva FB, odabrana tako da kada su blizu, moguć je BPE efekat. Možete dobiti sličan rang konformacijske (strukturne) promjene kod vjeverica. Na ovaj način se slični PB dodaju u različite dijelove proteinske molekule. Pojava BPE efekta ukazuje na blizinu FB, a time i na konformacijske promjene u promatranom proteinu. Na kom principu radi "konstrukcija" tri proteina, koji se koristi kao indikator umjesto Ca 2+ jona u živim ćelijama. Prije njega nalaze se dva PB i Ca 2+-vezujući protein kalmodulin između njih. Kada je Ca 2+ vezan, konformacija kalmodulina se mijenja, FB se približavaju i daju BPE signal. Ovdje je važno napomenuti da za registraciju Ca 2+ jona u sredini ćelija postoje “jednostavni” fluorescentni organski reporteri. Proteinski reporteri mogu se preciznije „adresirati“ na unutrašnje ćelijske komponente pjesme, bilo kroz dodatnu mikro-inkluziju ili kroz uključivanje u strukturu proteina sa ćelijskom unutrašnjom lokalizacijom.

Osetljivost fluorescencije na fizičke uticaje, mikropreciznost u kojoj se nalaze molekuli fluorofora, omogućava im da se koriste kao reporteri različitih parametara intracelularnog medija. Vibracije unutrašnjeg ćelijskog tkiva viskozitet Fokusira se na prisustvo polarizacije fluorescencije zbog aversne difuzije reportera. Zaista, posebno odabrani reporteri mogli su izmjeriti viskoznost citoplazme u sredini različitih organa, kao i hidrofobnu sferu biomembrana. Interakcije različitih fluorofora sa biološkim membranama zavise od razlike u električnim potencijalima između njih. Uz pomoć takvih novinara, pribavite informacije o veličini membranski potencijal. Za vimiru unutrašnja temperatura ćelije Razvijeno je više varijanti fluorescentnih reportera na bazi lantanida, kvantnih tačaka, termosenzitivnih polimera i organskih fluorofora. Najštetniji rezultati dobijaju se od posebno dizajniranih organskih fluorofora, koji su dizajnirani da „pokažu“ temperaturu različitih delova ćelija, „šifrovanih“ u dinamičkim parametrima fluorescentnog gašenja.

Koje su nove stvari naši fluorescentni reporteri naučili o mikrosvijetu?

Fluorescentni reporteri već duže vrijeme uspješno „serviraju“ eksperimentalnu biologiju i medicinu. Postoji samo nekoliko različitih opcija, ali sve dijele istu statistiku. Međutim, takvi galusi su odigrali ključnu ulogu u razvoju principa moći i manifestacija bioloških sistema. Njihovi postupci su značajni za ilustraciju.

Eksperimentalno je dokazana upotreba fluorescentnih reportera model rijetke kristalne strukture svih bioloških membrana*. Stoga, kod ovog modela, sa strukturnim integritetom i zagarantovanom barijerom prodiranja hidrofilnih supstanci, biološku membranu treba puniti „rijetko” kako bi se njene komponente mogle kretati „iza predviđenih namjena”. Ovakva otkrića o biološkim membranama omogućavaju razumijevanje osnovnih molekularnih mehanizama njihovog funkcioniranja, kao i snage živih stanica općenito.

* - Osim toga, fluorescentne tehnologije su sada utvrdile da membrana nije samo pasivno "more" fosfolipida, u kojem plutaju "ostrva" membranskih proteina, već i zakoniti učesnik u mnogim važnim biofizičkim procesima: « » . – Ed.

Mehanizmi transformacije energijeĆelije su takođe postale inteligentne zbog značajne količine informacija koje pružaju fluorescentni reporteri. Posebnu ulogu tu su imali fluorofori, koji omogućavaju registraciju unutrašnjeg ćelijskog i unutrašnjeg mitohondralnog pH*, kao i razlike u električnim potencijalima na membranama. Uz njihovu pomoć, prvi smo identificirali mehanizam za kombiniranje oksidacijskih reakcija koje daju energiju sa sintezom adenozin trifosfata (ATP), univerzalnog donatora energije za većinu metaboličkih procesa. Osim toga, priroda akumulacije različitih supstanci u citoplazmi u ćelijskim organelama pripisana je učinku membranskog električnog potencijala i pH gradijenta.

* - o uređaju fluorescentnog pH senzora diva. « » . – Ed.

Vitalnost ćelija je obezbeđena agregatom koordinirani u prostoru i vremenu biohemijske reakcije. Ova koordinacija je zbog specifične interakcije komponenti tzv signalizacija sistema Glavne komponente ovih sistema su izolovane i okarakterisane korišćenjem tradicionalnih tehnika biohemije i molekularne biologije. Međutim, s pojavom pristupa zasnovanih na stagnirajućim fluorescentnim reporterima, postalo je moguće ukloniti informacije o prostorno-vremenska organizacija signalnih ruta od sredine u kolenima. Dakle, na prvi pogled zaista možete pratiti prostornu dinamiku interakcije proteinskih komponenti signalnih sistema. Ovo omogućava širenje, jačanje i integraciju signala u ćelijama. Štaviše, postalo je moguće procijeniti dinamiku ekspresije gena na osnovu pojedinačnih ćelija, što nam omogućava da razvijemo koncept ćelijske individualnosti za razliku od tradicionalnih statističkih pristupa. Također je vrijedno napomenuti da je uz pomoć fluorescentnih reportera bilo moguće otkriti ranije nepoznate signalne komponente. Na primjer, otkrivena je važna uloga Ca 2+ jona kao signalnog posrednika u mnogim regulatornim reakcijama.

U drugoj polovini prošlog stoljeća mikrobiologija se susrela s problemom koji je nazvan „velika anomalija u pojavi mikroorganizama u Petrijevoj posudi“. “Pobjednici” su bili fluorescentni reporteri, dva jedinjenja nukleinske kiseline – narandžasti akridin i 4,6-diamidino-2-fenilindol. Brojna istraživanja prirodnih uzoraka dosljedno su otkrivala nedosljednosti između podataka o prisutnosti mikroorganizama prikupljenih u obliku kolonija stanica koje se razmnožavaju u Petrijevim posudama i podataka iz direktnih istraživanja i upotrebe mikroorganizama, pripremljenih uz pomoć fluorescentnih nukleinskih kiselina, uz pomoć mikroskopa . Fluorescentni reporteri su od tada otkrili znatno više mikroorganizama u analizi Petrijeve posude. Za objašnjenje ovih podataka postavljene su dvije hipoteze. Prije svega, neke od ćelija mogu ostati "tihe" i ne razmnožavati se u Petrijevim posudama. S druge strane, kultura (srednje skladištenje, temperatura itd.) ne zadovoljava “potrebe” nijednog dijela populacije za reprodukcijom. Provjera ovih hipoteza pokazala je da se ove mogućnosti mogu realizirati. Štaviše, dobila je naređenja prije formiranja dvije nove velike direktne linije.

Prvi je povezan s uzgojem takozvanih “životonosnih, osim ako se ne uzgajaju mikroorganizmi”. p align="justify"> Poseban značaj ovoga direktno je određen prisustvom takvog fenomena kod mnogih patogenih mikroorganizama za ljude. U ovom slučaju, cijeli smrad je nekako „nevidljiv“ za standardne dijagnostičke metode. Osim toga, ovaj smrad će imati veću otpornost na medicinske lijekove.

Druga direktna tačka je otkrivanje i razvoj mikroorganizama direktno u prirodnim oblicima (lat. in situ, bukvalno - na mjestu) direktnom analizom njihovih nukleinskih kiselina bez potrebe za dobijanjem čistih kultura, kao što je ranije bio slučaj. Direktno reci ovome, otkidajući dlaku imena - metagenomika. Danas su metagenomske metode, uključujući i one zasnovane na fluorescentnim reporterima, omogućile ponovnu procjenu biološke raznolikosti mikroorganizama u drugim ekosistemima na Zemlji. Tako su “nevidljivi” izvještaji dvojice fluorescentnih reportera sakrili pojavu dvije najvažnije linije istraživanja u modernoj mikrobiologiji.

Pa, današnji fluorescentni reporteri su velika armija različitih "lažnih ljudi" koji već imaju slavnu istoriju u eksperimentalnoj biologiji i medicini. Njihovi fluorescentni izvještaji omogućili su da se bolje "gledaju" oni džepovi mikrosvjetla u koje bi svjetlost mogla prodrijeti. Štaviše, pogledajte i vizuelno i na prvi pogled razumevanje fizičkih, hemijskih i bioloških zakona. Pa ipak, potomci, koji rade na razvoju i stagnaciji ovih “molekularnih nuspojava” u mikrosvijetu, poštuju da ovo nije ništa drugo do klip!

Video snimak 5. seminara Za mlade studente Instituta za bioorgansku hemiju RAN: „Tehnologija akustičkog fokusiranja čestica u protočnoj citometriji“;

Lipidni temelj života ;

Nano pH metar ;

Prema difrakcijskoj barijeri: Nobelova nagrada za hemiju 2014 ;

Pučkov E.O. (2014). Fluorescentni reporteri i njihovi izvještaji. Hemija i život № 9 (2014) , 8–13. .

POGLAVLJE 1.

Uvođenje fluorescencije

Luminescencija- varijacija fotona iz elektronski pobuđenih stanja - deli se na dva tipa u zavisnosti od prirode glavnog i pobuđenog stanja. energija je iza spinalne orijentacije? Čini se da je ova elektronika uparena*. U tripletnom sistemu, elektroni tada nisu upareni. Njihova leđa su u istoj orijentaciji. Prilikom rotacije elektrona iz probuđenog singletnog spina, osnovna orijentacija njegovog spina se ne mora mijenjati. Promjena orijentacije okretanja je neophodna kada se prelazi sa trostrukog omamljivanja na glavni singlet stan. Fluorescencija- ovo je promjena koja se događa kada se upareni elektron rotira na nižu orbitalu. Takvi prelazi su kvantno mehanički „dozvoljeni“, a tipične vrijednosti fluidnosti za njih su ~10 8 z -1. Visoke vrijednosti brzine vibracije rezultiraju satima gašenja fluorescencije od ~ 10 -8 s (10 ns). Sat života je srednji period tokom kojeg je fluorofor u probuđenom stanju. Fosforescencija- to je promena koja se dešava tokom prelaza između stanja različite multipličnosti**, po pravilu, iz probuđenog tripletnog stadijuma u glavni singlet. Takvi prijelazi nisu dozvoljeni, a konstante fluidnosti su podložne promjenama. Tipičan raspon vremena gašenja fosforescencije je od milisekundi do sekundi, što je prvenstveno zbog drugih procesa deaktivacije. U ovoj knjizi možemo jasno vidjeti tekući proces fluorescencije.

U jedinjenjima koja pokazuju značajnu fluorescenciju, elektroni su važni delokalizovani i formalno raspoređeni na prijemnom kraju.

* Ispravnije bi bilo reći da su poleđine ovih elektrona uparene. Elektroni koji se nalaze na istoj orbitali nazivaju se upareni, - Napomena. ed.

** Višestrukost će se zvati vrijednost m = 2s + 1, gdje je s ukupan spin elektrona datog stanja. Dakle, za singletone t = 1 i s = 0, za trojke - t = 3 i s = 1 - Ed.

Strukture nekih tipičnih fluorofora prikazane su na Sl. 1.1. Jedan od najčešćih fluorofora je kinin, koji se dodaje toničnim pićima. Ako se začudite bočici tonika postavljenoj na upaljenu svijeću, često možete dobiti slabu svijeću. Najuočljivije je da se bočici možete diviti pod direktnim rezom na direktnom sunčevom svjetlu, kao i da je stalna električna promjena posljedica prisustva aditiva. Kinin, koji je pobuđen ultraljubičastim vibracijama sunca, kada se okrene ka glavnoj pozornici, proizvodi tamno svjetlo sa vrhom od oko 450 nm. Pojava fluorescencije se često može poboljšati raznim aditivima. Na primer, zeleni ili crveno-narandžasti sjaj koji se primećuje u antifrizu verovatno je posledica količine fluoresceina ili rodamina u tragovima (slika 1.1). Nuklearni aromatični ugljikohidrati, kao što su antracen ili perilen, također fluoresciraju, što se često može primijetiti u tamnoj fluorescenciji benzina. I otkrili smo da supstance kao što su PPO i POPOP snažno fluoresciraju, koje se detektuju u "scintilacionim" aplikacijama i biohemijskim istraživanjima. Ostale primjene će biti date u knjizi s referencama na snagu pojedinačnih fluorofora. Pored molekula organskih aromatičnih poluprovodnika, važno je da oni ne fluoresciraju u fazi kondenzacije.

MAL. 1.1. Strukture tipičnih fluorescentnih jedinjenja.

MAL. 1.2. Spektri gline i varijacije fluorescencije perilena i kinina (slijedeći podaci).

Spektri vibracija se ne mogu pravilno prikazati istovremeno u skali dovgin hvil i u skali hvil brojeva. U ovom slučaju, ispravna slika je prikazana na skali brojeva. Dvostruko zašiljen zbog praktičnosti (div. Poglavlje 2).

Jedan značajan krivac je grupa elemenata zvanih lantanidi [1]. Fluorescencija jona Evrope i terbija uzrokovana je prijelazima elektrona između njih f- orbitale koje su ekranizovane od izvora sa više ispunjenim orbitalama.

Fluorescentni spektralni podaci moraju biti predstavljeni u obliku spektra vibracija. Spektar fluorescencije- ovo je dubina intenziteta fluorescencije u dovzhin hvil (nanometrima) i hvil brojevima (cm -1). Dva tipična spektra fluorescentnih vibracija prikazana su na slici 1.2. Spektri vibracija uvelike variraju i zavise i od hemijske strukture fluorofora i od izvora fluorofora. Spektri takvih objekata, kao što je perilen, imaju jasnu strukturu, okruženi snažnim kolateralnim nivoima energije glavnog i probuđenog stanja. Druge supstance, kao što je kinin, pokazuju spektre bez kovalentne strukture.

*Kolivalnu strukturu vibracionih spektra ukazuju kolivalna stabla glavnog, a ne probuđenog elektronskog stanja (za izveštaj, pogledajte dole). - Napomena... ed,

1.1. Yablonskaya dijagram

Uglačano i pojačano svjetlo bolje je ilustrovano dijagramom jednakih energija, koji je predložio Yablonski [3]. jednaki, koji su označeni sa 0, 1, 2, itd. Oficirska infuzija se ne prihvata s poštovanjem, ali će se izveštaj pogledati u golu. 7. Prelazi između različitih elektronskih nivoa označeni su vertikalnim linijama. Ova vrsta vistave se koristi da bi se jasno prikazala priroda glinenog svjetla. Ovaj proces traje otprilike 10 -15 s, sat prekratko za značajno pomicanje jezgara (Frank-Condon princip).

Energetski jaz između različitih nivoa energije vidljiv je u spektru vibracija perilena (div. sl. 1.2). Istovremeno, maksimum vibracije (a samim tim i nivo energije) ostaje isti na približno 1500 cm-1. Prividni broj molekula perilena koji su prisutni u aparatima za kopiranje 0 i 1 opisuje Boltzmannova podjela:

Odnos R broja molekula u dva stanja sa razlikom energije E dat je izrazom

R = e -  E/kT (1.1)

de k – Boltzmannova konstanta; T je apsolutna temperatura, K. Na sobnoj temperaturi 300, R dostiže 0,01 prije zrelosti. Također, većina molekula je prisutna u donjem koliformu; Sami takvi molekuli lagano blijede.

MAL. 1.3. Dijagram Yablonskaya.

Zbog velike razlike u energijama između nivoa S 0 i S 1, u suštini, u trenutnim fluoroforima, područje S 1 ne može biti naseljeno termalnim putem. To znači da je zbog male termičke aktivnosti bez populacije prvog probuđenog kolivalnog stanja molekula moguće registrovati vikorističku varijabilnost spektra gline na različitim temperaturama.

Poliranje svjetlosti je praćeno nizom drugih procesa. Destrukcija fluorofora se, dakle, povećava do visokog nivoa koncentracije (S 1 i S 2). 3a zbog određenih rijetkih svojstava, molekule u fazi kondenzacije karakterizira brza relaksacija do niže razine formacije S 1 . Ovaj proces se zove interna konverzija a očekuje se da će biti veća za 10 -12 s. Tipični fragmenti sati gašenja fluorescencije blizu 10 -8, interna konverzija će se gotovo sigurno završiti prije procesa konverzije. Također, do širenja fluorescencije najčešće dolazi zbog termički jednako važnog buđenja. Na sličan način, povratni prelaz elektrona na niži nivo elektrona takođe dovodi do kolateralno probuđenog stanja (slika 1.3). Toplotna temperatura se postiže za sat vremena, 10 -12 s. Glavna posljedica ovog gledišta je da spektar molekula gline odražava kovalentnu strukturu pobuđenih elektronskih stanja, a spektar vibracija kovalentnu strukturu glavnog elektronskog stanja. U većini epizoda, elektronsko buđenje ne mijenja značajno širenje nivoa kolateralne energije. Kao rezultat toga, kovalentne strukture, poput onih u spektrima, su polirane i modificirane, slične.

Molekuli u stanju S 1 također mogu biti podvrgnuti konverziji u prvi triplet T 1 stadijuma. Konverzija S 1 u T 1 se zove Interkombinacija konverzije. Prijelaz sa T 1 na glavnu stanicu za blokiranje, zbog čega je konstanta fluidnosti takve promjene nekoliko redova veličine manja od odgovarajuće konstante za fluorescenciju. Na fluorescentnu emisiju mogu uticati i drugi faktori koji nisu jasno prikazani na Sl. 1.3: priliv iritansa, opuštanje iritansa, gašenje i dalje reakcije poput stanja buđenja. Svi će oni biti detaljno razmotreni u narednim dijelovima knjige.
1.2 Karakteristike fluorescentne stimulacije

Za detekciju fluorescencije vidljivi su brojni glavni indikatori. Nema tragova, ali je miris rijedak. Zbog nižih karakteristika prekomjerne reakcije ovog fluorofora, moguće je izvući zaključke o djelovanju pojedinih autoriteta u ovoj oblasti,

1.2.1. Stokes ruin

Pobrinite se da uvijek vodite računa o važnosti promocije gline prije velikog dovžina hvila. gubitak energije (isključeno – atomi u gasnoj fazi). Tse je prvi čuvao Stouk 1852. u Kembridžu [4], koristeći ovu opremu, princip iza slika na sl. 1.4. Izvor ultraljubičastog buđenja bila je sunčeva svjetlost, propuštena kroz tkaninu od crnog stakla. Prije upotrebe kao svježi filter, stoji boca vina, fluorescencija kinina leži u području od 450 nm i stoga je jasno vidljiva. Nina vrednuje Stokesovu vrijednost koristeći druge metode.

Rasipanje energije između aktivacije i vibracije uvijek se izbjegava za fluorescentne molekule u različitim industrijama. Jedan od glavnih razloga za krivca Stokesovog sindroma je brza relaksacija donjeg kovalentnog nivoa S1. Pre toga dolazi do prelaska na buđenje kolivalnog nivoa S0 (div. sl. 1.3), što će dovesti do dodatne potrošnje kolivalne energije.

MAL. 1.4. Šema prve instalacije za detekciju Stokes ZSUV.

Pored ove količine stresa, može postojati još veći doprinos prilivu trgovaca na fluorofore i reakcijama u probuđenim zemljama. U gasnoj fazi atomi i molekuli su uvek uništeni. Otpuštanje bez prekida se izbjegava ako je koncentracija plina niska, tako da probuđeni molekuli ne stupaju u interakciju s drugim molekulima prije procesa oslobađanja. Takva napetost dovodi do opuštanja. U rijetkoj fazi, proces gašenja se odvija kontinuirano.
1.2.2, Nezavisnost spektra u slučaju maksimalnog buđenja

Spektar propagacije fluorescencije trebao bi ostati do kraja dana. Kada se aktiviraju nivoi elektronike i kopirke, višak energije se gubi, prenoseći fluorofor na niži S 1 . Ovo opuštanje se dešava za oko 10 -12 s u jednom satu, možda kao rezultat snažnog preklapanja ravnodušnosti sa približno jednakim energijama. Međutim, ova vrsta brzog opuštanja nakon intenzivnog buđenja ne mora se nužno uklapati u spektar vibracija. Postoje problemi (na primjer, azulen), ako istaknutost može biti ili od S 2 - ili od S 1 - postaću. Osim toga, aktivacija na crvenom kraju spektra često dovodi do fluorescencije u Dovgokhvilijevom području. To je zbog činjenice da je aktivacija na tamnom kraju spektra vjerovatnija za one fluorofore koji najviše komuniciraju s izvorom.

1.2.1 Pravilo simetrije ogledala

Uporedi spektar intenziteta fluorescencije sa zrcalnim refleksijama spektra gline, tačnije one gline koja ukazuje na prelazak sa S 0 na S 1. Ovo posebno važi za perilen (div. sl. 1.2). Na simetričnu prirodu ovih spektra ukazuje činjenica da je i prefinjenost i izraženost formiranja samih ovih prelaza, kao i sličnost kolapsirajućih energetskih nivoa S0 i S1. Za mnoge molekule, različita raspodjela elektrona u S0 i S1 stanjima ne doprinosi istoj energiji. Na osnovu Franck-Condon principa, svi elektronski prelazi se dešavaju bez promene međunuklearnog interfejsa. Kao rezultat toga, budući da je nivo prijelaza (Frank-Condon faktor) između nulte i drugih nivoa kolaterala maksimalan kada je poliran, odgovarajući prijelaz će također biti najviši u opuštenom (slika 1.5).

MAL. 1.5. Pravilo zrcalne simetrije i Franck-Condon faktor.

Neophodno razmatranje za simetriju ogledala je predstavljanje spektra, poliranje i viprominiranje sličnih jedinica. Najbliža simetrija je odgovorna za razliku između modifikovanih spektra (v)/v i F(v)/v 3, gde je  (v) koeficijent agradacije, koji odgovara broju v, a F(v) je trenutni tok fotona u intervalima brojeva Δv [5]. Za aromatične polinuklearne ugljikohidrate mora se pratiti konzistentnost između takvih spektra.

Bez obzira na to, pravilo zrcalne simetrije se često krši, a za to postoje mnoge greške. Gundak jaka na sl. 1.6 prikazuje spektre fluorescencije difenila. Spektar vibracija pokazuje kolivalnu strukturu, kao i svaki drugi dan u spektru gline. Takvo pridržavanje pravila zrcalne simetrije omogućava prepoznavanje različite geometrijske raspodjele jezgara koja je važna u probuđenom stanju.

MAL. 1.6. Spektri gline i vibracije difenila.

Miješanje jezgara može početi prije nego što će proces vibracije kroz veliki sat života postati S 1. U slučaju bifenila, vjerovatno je da prstenovi oko njih postaju komplanarni kada se probude, zbog čega spektar vibracija postaje strukturiraniji od spektra gline. Difenil nije samo poboljšanje pravila simetrije ogledala, ali ne samo zato što njegov spektar vibracija ima jasniju vidljivu kovalentnu strukturu i niži spektar poliranja. Čuvajte se suprotne slike.

Kombinacija geometrijskih pregrupisavanja i pravila zrcalne simetrije može izazvati reakcije u stanjima buđenja. Tako, na primjer, za fenol i tirozin postoje dvije vrste vibracija, a dvostruka vibracija je uočljivija pri visokim koncentracijama akceptora protona (div, sl. 11, 18). Vrijednost pK fenolne hidroksilne grupe mijenja se od 11 općenito do 4 u probuđenom stanju.

MAL. 1.7. Spektri vibracija pirena i yogo eksimera (sljedeći podaci).

Prividni intenzitet maksimalne fluorescencije ekscimera (470 nm) mijenja se sa smanjenom koncentracijom pirena od 6x10 - 3 M (gornja kriva) do 0,9x10 -1 M (donja kriva).
Nakon buđenja, fenolni proton se kreće na akceptore protona na poseban način. U zavisnosti od koncentracije ovih akceptora, spektar može uticati na fluorescenciju ili fenola ili fenolata. Važno je napomenuti da bez obzira na prisustvo aktivnih grupa, mnogi polinuklearni aromatični ugljikohidrati također reagiraju u uvjetima buđenja. Tako se, na primjer, molekule pirena u pobuđenom stanju kombinuju u komplekse zvane ekscimeri (skraćeno od pobuđenih dimera). Oslobođeni ekscimeri se miješaju u Dovgochvilijevu regiju i izravnavaju promocijom pirenskih monomera, što rezultira novom kovalentnom strukturom (slika 1.7). Kompleksi koji se razvijaju u probuđenom stanju nazivaju se eksiplex.
1.3. Sati izumiranja i izlaz kvantne fluorescencije

Često postoje sati izumiranja i kvantnog izlaza fluorescentnih emisija. Smisao ovih parametara je jasno vidljiv iz modifikovanih dijagrama Jablonskog (slika 1.8). U ovom dijagramu ne prikazujemo detaljno procese relaksacije koji dovode do relaksiranog stanja S 1, ali stavljamo veliki naglasak na procese koji su odgovorni za povratak u glavno stanje. Zokrem, možemo pronaći konstantu fluidnosti fluorofora (G) i konstantu fluidnosti neprominuvalne deaktivacije na stanici S 0 (k).

Kvantni prinos fluorescencije- ovo je odnos između broja emitovanih fotona i njihovog nestanka. Očigledno, konstante likvidnosti ukazuju na procese promjene stanovništva probuđene zemlje. Dio molekula fluorofora koji se deaktivira vibracijom, pa je kvantni prinos određen reakcijom

Q = R/(R+k) (1.2)

Kvantni prinos je u ovom slučaju blizak jedinici, pošto je konstanta likvidnosti neizražene deaktivacije mnogo manja od konstante likvidnosti vibracije koja se očekuje manja od jedan kroz Stokesovu potrošnju. Radi jednostavnosti, grupisali smo sve moguće procese bešavne deaktivacije u jednu konstantu fluidnosti k.

MAL. 1.8. Yablonskaya dijagram je izmijenjen.

Sat života probuđenog stanja određuje se kao srednji sat tokom kojeg je molekul proveo vrijeme na probuđenom mjestu prije nego što je prešao u glavno stanje. Postavite sat ekstinkcije fluorescencije na -10 ns Za fluorofor, koji je opisan dijagramom Yablonsky (slika 1.8), sat ekstinkcije je stariji.

τ = 1/(G+k) (1.3)

Važno je zapamtiti da propagacija fluorescencije nije zabluda.
Kao rezultat, molekuli obično oslobađaju fotone pri t = τ. Sat života je
prosječna trivijalnost iskustva u probuđenom stanju. Na recepciji
re za jedno-eksponencijalno izumiranje izazvano na cilju. 3,63% molekula je u satu t = τ, a 37% je u satu t > τ. Sat života fluorofora bez nepotaknutih procesa naziva se najvažnijim satom života *,τ 0, drevni

τ 0 = 1/G (1.4)

Odnos između kvantnog izlaza i sata je očigledan.
zivot sa njim:

Q = τ / τ 0 (1.5)

Kvantni izlaz u isto vrijeme života može se mijenjati ovisno o bilo kojem faktoru koji utječe na konstante fluidnosti. Na primjer, može se činiti da molekul fluorescira neprepoznatljiv zbog visoke fluidnosti unutrašnje konverzije ili minimalne fluidnosti izmjene. Scintilatori su odabrani zbog svojih visokih kvantnih prinosa, koji su rezultat visokih G vrijednosti. Očekuje se da će imati kratak vijek trajanja, oko 1 ns. Fluorescencija aromatičnih sulfata, koja sprečava da grupa N0 2 bude slaba, prvenstveno je posledica velike vrednosti k. Triplet-singletna tranzicija prepreka u simetriji i konstanta fluidnosti spontane vibracije postaje ~10 3 s-1 ili manje **. Vrijednost k je blizu 10 9 s-1, kvantni prinos fosforescencije je mali na sobnoj temperaturi. Iz jednačine (1.2) moguće je izračunati kvantne prinose fosforescencije, koji su veći od 10 -6.

* Ispravnije bi ovo bilo nazvati radijativnim (viprominentnim) satom života. - Pribl. ed.

** Autor sugerira visoku vrijednost k za intramolekularnu, neupadljivu deaktivaciju tripletnih spojeva, koja se rijetko događa - samo za molekule koji prolaze kroz hemijske reakcije (okrecija, izomerizacija). Kroz spin ogradu, neproliferativni interkombinacioni prelaz T 1 → S 0 za većinu molekula ima konstantu likvidnosti k 1.4. Fluorescentna anizotropija

Za fluorofore je važno da pretvore one fotone, električne vektore koji su direktno paralelni momentu prijelaza u fluorofor. Trenutak prijelaza određuje specifičnu orijentaciju molekula fluorofora. U izotropnim jedinjenjima, molekuli fluorofora su orijentirani linearno. Kada su pobuđeni polariziranom svjetlošću, ti molekuli fluorofora se selektivno pobuđuju, za koje je dipolni moment prijelaza paralelan s električnim vektorom uzbudljive svjetlosti (odjeljak 5.2.1). Takva selektivna aktivacija djelomično orijentiranog skupa fluorofora (fotoselekcija) dovodi do djelomično polarizirane proizvodnje fluorescencije. Za kožni fluorofor, momenti prijelaza za poliranje i vibracije mogu imati fiksnu orijentaciju, a između njih maksimalna prigušena anizotropija r 0 div. r_vnyannya (5.20)]. Anizotropija (r) i polarizacija (P) fluorescencije izražene su jednakim vrijednostima

(1.6), (1.7)

de I || í I ┴ intenzitet fluorescencije vertikalno (II) i horizontalno (┴) polarizovane vibracije kada je slika oštećena vertikalno polarizovanim svetlom. Anizotropija i polarizacija su izrazi istog fenomena, pa se mogu zamijeniti, koristeći i jednačine (5.3) i (5.4). Nekoliko faktora može promijeniti vrijednost anizotropije na vrijednost ispod maksimuma. Najrasprostranjenija od njih je indirektna difuzija, koja se javlja tokom jednog sata života u probuđenom stanju i istiskuje fluorofor koji oslobađa dipol. Varijacija ovog parametra daje informacije o ukupnom miješanju fluorofora u intervalima između poliranja i ponovnog miješanja. Prijenos energije ekscitacije između fluorofora također dovodi do promjene anizotropije.

Moguće je da je jedini suštinski proces koji može dovesti do promjene anizotropije reverzna difuzija. Ako se anizotropija smanji, tada će se odrediti anizotropija

,

gdje je r 0 anizotropija, koja je odgovorna za utjecaj aversne difuzije, a φ je sat korelacije za proces difuzije, koji se određuje kao

φ = ηV/kT (1.9)

de η - viskozitet; k – Boltzmannova konstanta; T – apsolutna temperatura; V je zapremina umotanog fragmenta. Pogledajmo protein sa molekulskom težinom od 50.000 Pitoma fragmenata, volumen proteina je 0,73 ml/g, može se lako osušiti, tako da na 25°C u vodi (n = 0,00894 P) vrijeme oporavka korelacije. je 13 ns za bezvodnu sferu. Fragmenti proteina su hidrirani, a stvarno vrijeme korelacije može biti duže. Međutim, jasno je da se satovi ukupne korelacije za većinu proteina mogu izjednačiti sa tipičnim časovnicima gašenja fluorescencije. Stoga, rezultati zatamnjivanja anizotropije fluorescencije leže među ostalim faktorima koji doprinose fluidnosti globalne difuzije. Stoga se modifikacija polarizacije fluorescencije široko koristi za modifikaciju hidrodinamičkih snaga makromolekula.

1.5. Vremenska skala molekularnih procesa u poljoprivredi

Fluorescentna spektroskopija je efikasna metoda za proučavanje dinamičkih procesa u vrstama, što je od interesa za biologe. Takva sposobnost je vezana za nas unaprijed od časa života u probuđenim stanjima. Prateći Franck-Condon princip, apsorpciona spektroskopija može pružiti informacije samo o prosječnim karakteristikama glavne strukture molekula koje su lagano izblijedjele. Fragmenti ovih mo-ija smole, koji direktno prianjaju na čestice gline, uključeni su u njihov spektar gline, apsorpciona spektroskopija može dati informacije samo o srednjoj solvacionoj ljusci smole, o sjediti s hromoforom, a ne predstavljaju molekularnu dinamiku.

Naprotiv, parametri fluorescentne spektroskopije su osjetljivi na funkcije svih procesa koji se dešavaju u toku jednog sata buđenja, a u tim procesima mogu učestvovati molekuli koji su prisutni u trenutku buđenja na nivoima do 100 A u ID. fluorofor. Iako se može reći da je 10 ns vrlo kratak vremenski period, to je zapravo odlično vrijeme u prastarom razvoju malih molekula u rijetkim vrstama. Vertikalna difuzija fluorofora vezanih za proteine ​​i membrane također spada u ovaj satni raspon.

Gašenje fluorescencije molekularnom kiselinom iza mehanizma zatvaranja je ilustrativan primjer veličine prostranog i vremensko-satnog raspona, što se čini kao sat izumiranja fluorescencije. Kako se fluorofor, koji je u probuđenom stanju, sudara s molekulom kiseline, on rotira u glavnom stupnju bez vibriranja fotona. Koeficijent difuzije kiseline u vodi na 25 °C ostaje 25 10 -3 cm 2 /s. Prosječna udaljenost [(Δx 2) 1/2], na kojoj molekul kiseline može difundirati za 10 -3 s, izračunava se prema Einsteinu:

Δ x 2 = 2Dτ (1.10)

Podignite [(Δx 2) 1/2] da postane ~ 70 Å, što je prilagođeno debljini biološke membrane ili prečniku proteina. Za neke fluorofore životni vek dostiže 400 ns, pa je moguće sprečiti difuziju molekula kiseline na naponu od preko 450 A. Međutim, zatamnjivanje gline daje samo informaciju o ekstremnom izoštravanju fluorofora i samim tim, oko ve srednje oštrine.

Priliv molekularne dinamike u spektre fluorescencije takođe se otkriva posmatranjem energije. Organski molekuli, po pravilu, lagano svijetle u rasponu od 200-500 nm, što odgovara energijama od 140 do 60 kcal/mol. Nakon poliranja, dipolni moment fluorofora se mijenja (ili povećava). Pošto molekuli agensa imaju i dipolne momente, oni se preorijentišu prema probuđenom dipolu, smanjujući njegovu energiju. Ovaj proces se naziva opuštanje počinitelja i javlja se u rijetkim slučajevima unutar 10 -12 s. Opuštanje prodavača može dovesti do značajnih gubitaka zaliha. U proteinima, višak triptofana lagano blijedi na 280 nm i emituje fluorescenciju na -350 nm. Dakle, u nekoliko nanosekundi koje se odvijaju prije procesa vibracije, troši se 20 kcal/mol.

U srcu svakog eksperimenta leži svijet određene veličine i korelacija između rezultata i fenomena koji je od interesa za istraživača. Vremenski raspon između poliranja svjetlosti i daljnjih modifikacija je dovoljan da se provede nekoliko procesa koji dovode do slabljenja spektralnih karakteristika fluorescencije. Prije ovakvih procesa postoji veza sa aparatima za gašenje požara, reverzna i progresivna difuzija, stvaranje kompleksa sa agensima ili otopljenim spojevima, te preorijentacija preciznog molekula u probuđenom stanju zbog promjene dipolnog momenta. Ovi dinamički procesi mogu uticati na anizotropiju fluorescencije, kvantne prinose, životne sate i spektre vibracija. Kao rezultat toga, spektralne karakteristike fluorofora mogu pružiti velike informacije o dinamičkim procesima koji se dešavaju tokom sata fluorescentne emisije.

1.6. Fluorofor

1.6.1 Prirodni fluorofori

Veliki broj bioloških molekula sadrži mnogo prirodnih ili prirodnih fluorofora. Ukratko pružamo informacije o širokom spektru fluorofora koji predstavljaju osnovu za sljedeće odjeljke. Takav sažetak nije dovoljan.

PROTEINI Triptafan je najintenzivnija fluorescentna amino kiselina u proteinima. Otprilike 90% fluorescencije proteina je zbog viška triptofana. "Ovaj prirodni fluorofor je izuzetno osjetljiv na polaritet ekstremne sredine. Spektralni poremećaji se često javljaju u mnogim fenomenima, među kojima se može vidjeti vezivanje liganda, asocijacija protein-protein i denaturacija Yu. Osim toga, maksimalna proizvodnja proteina odražava prosječnu dostupnost njihovih viškova triptofana blizu 280 nm, a maksimumi spektra fluorescencije leže u području od 320 -350 nm.

Tirozin intenzivno fluorescira u proteinima, njegova fluorescencija je mnogo slabija u proteinima. Denaturacija proteina dovodi do promocije tirozina. Što se tiče fenola, sadržaj tirozina se jako mijenja nakon buđenja, a tokom buđenja može doći do jonizacije.

Nukleinske kiseline Nukleotidi i nukleinske kiseline ne fluoresciraju. Postoji nekoliko stvari koje treba kriviti. tRNA Phe iz kvasca sadrži intenzivno fluorescentnu bazu, poznatu kao Y-baza, koja ima maksimalnu istaknutost oko 470 nm i životni vijek od ~6 ns.

NADH kofaktor snažno fluorescira, a maksimumi njegove apsorpcije i vibracije nalaze se na 340 i 450 nm, konzistentno. NAD+ ne fluorescira. Vrijeme gašenja NADH fluorescencije u vodenom puferu postaje približno 0,4 ns. Fluorescentna grupa je prisutna u nikotinamidnom prstenu, a njena fluorescencija se često gasi zbog zamućenja usled viška adenina. Kada je NADH vezan za proteine, kvantni prinos fluorescencije se značajno povećava. Ovaj povećani prinos može se protumačiti kao posljedica vezivanja NADH u rastegnutoj konformaciji, što je potvrđeno rendgenskim difrakcijskim studijama hidrogenaza.

RIBOFLAVIN I FAD. Riboflavin, FMN (flavin mononukleotid) i FAD (flavin adenin dinukleotid) su lagani u vidljivom području (-450 nm) i oslobađaju se u području od 515 nm. Tipični životni sati za FMN i FAD su 4,7 i 2,3 ns dnevno. Kao i kod NADH, fluorescencija flavina se dinamički gasi adeninom. Nadalje, FAD također stvara simbiotske komplekse, u kojima se fluorescencija flavona gasi adeninom (statičko gašenje). Flagoproteini uglavnom ne fluoresciraju, ali opet postoje problemi.

1.6.2. Komad fluorofora

Često se prirodna fluorescentna svojstva makromolekula ne mogu ukloniti iz eksperimentalnih informacija. Tako, na primjer, fluorescencija proteina i rezultirajuća polarizacija ove fluorescencije ne predstavljaju fenomen koji bismo željeli striktno okarakterizirati.

ISOCYANATI I ISOCYANATI FLUORESCENCIJA I RODAMINE. Ove školjke se široko koriste kao oznake za proteine. Imunoglobulini označeni fluoresceinom – komercijalni reagensi; Često se uočavaju u fluorescentnoj mikroskopiji. Same ove riječi su odabrane kroz visoke kvantne prinose i stabilnost do foto-ekspozicije. Osim toga, zbog velikog napretka u glinenju i reprominentnosti (slika 1.9), problem pozadinske fluorescencije bioloških čestica je minimiziran i stagnacija kvarcne optike se može eliminirati. Izocijanatne ili izotiocijanatne grupe nalaze se ili u meta- ili u para položaju prema karboksi grupi (div. sl. l.l). Komercijalno označeni reagensi imaju širok raspon izomera. Ove školjke prvo reagiraju s proteinima lizina i cisteina. Vrijeme ekstinkcije fluorescencije školjkaša je približno 4 ns, a spektar vibracija nije previše osjetljiv na polaritet izvora. Ove žutike su vrlo pogodne za visokostepenu asocijaciju malih označenih molekula s proteinima na osnovu promjene polarizacije fluorescencije.

Dansil hlorid. Dansil hlorid (DNS-C1) se široko koristi kao proteinska oznaka (slika 1.10), posebno u ovim slučajevima, kada se vrši vibrirajuća polarizacija. Ova ideja je odavno poznata [8] i životni vijek fluorescencije je kraći (~ 10 ns). Na spektar vibracija dasilne grupe snažno utiče polaritet prekidača.

MAL. 1.9. Spektri buđenja i vibracije pošasti γ-globulina. fluorescein obeležen izotiocijanatom (prema podacima iz [7]).

MAL. 1.10. Jednodijelni fluorofori koji se često koriste u istraživanjima.

Kao nekovalentno vezane sonde za proteine ​​i membrane. Ove sonde možda neće fluorescirati u vodi, ali intenzivno fluoresciraju bilo kada su raspoređene u nepolarnim spojevima ili kada su povezane s makromolekulama. Nizak kvantni prinos vodene faze omogućava u mnogim slučajevima da se ne uključi nijedan dio fluorofora, što pojednostavljuje eksperimente. Takvi fluorofori su povezani sa serumskim albuminima, lipoproteinima, apomioglobinom, imunoglobulinima i lipidnim dvoslojevima. Mjesto je povezano, možda, i polarne i nepolarne prirode.

Hidrofobne membranske sonde. Lipidi ne fluoresciraju. Membrane su često označene sondama kao što su perilen, 9-vinil antracen i 1,6-difenilheksatrien (DPH) (slika 1.10). Ove sonde su nezamjenjive u vodi i postavljaju se na hidrofobni dio membrane. Nesupstituisani bogati nuklearni aromati, ugljeni hidrati i DPH su neosetljivi na polaritet izvornika. One se prvo koriste za procjenu unutrašnjeg viskoziteta suspendiranih kuglica u odnosu na polarizaciju njihove fluorescencije (odjeljak 5.7.1). Pomoću direktne promjene, kemijske sonde se mogu lokalizirati na odabranim dijelovima membrane. Jedna takva primjena je trimetilamonijumova so DPH (TMA-DPH). Važno je da naelektrisanje atoma dušika dovodi do lokalizacije TMA-DPH u području lipid-vodene granice membrane [14].

Druge sonde, kao što je PATMAN (slika 1.11), su veoma osetljive na fazno stanje lipidnih dvoslojeva [9]. Na temperaturi membrane, spektar vibracija RATMAN-a pada na 40 nm u Dovgokhvilijevom području: od 425 do 465 nm. Očigledno, ova sonda reaguje na relaksaciju membrane blizu dipola pobuđenog fluorofora (odeljak 8.6). Instalirane su i druge sonde. Osjetljivost na membranski potencijal može biti povezana s promjenom orijentacije sonde ili njene lokalne koncentracije u membrani, kao i sa ulivanjem električnog polja u elektronsku distribuciju u sondi [11]. Ako pronađete, možete vidjeti sonde koje će vam reći reakciju u probuđenom stanju. Kada se probudi, sonda P 2 -3 3 može otopiti intramolekularni ekscimer, a dio eksimera koji je otopljen pokazuje viskoznost u njihovoj najbližoj koncentraciji.

Nukleinske kiseline. Kada se uvede etilensko mjesto, fluorescencija ATP-a i njemu sličnih postaje intenzivna [12]. Takvi aktivni ε-ATP (slika 1.11) su osjetljivi na viskoznost agensa i pokazuju visoku marginalnu polarizaciju fluorescencije, a vrijeme gašenja njihove fluorescencije je blizu 23 ns. Nukleotidni analozi su aktivni u mnogim reakcijama koje kataliziraju enzimi. Osim toga, sintetizirani su analozi nukleotida sa rastegnutom konformacijom, kao što je linija-benzo-AMP.

Navodno, možemo reći da je fluorescencija uzrokovana različitim molekulima, a spektralna snaga fluorofora doprinosi niskim zvaničnicima i procesima. Kao rezultat toga, fluorescentne metode se koriste za razvoj moći vlasti i bioloških makromolekula.

MAL. 1.11. Jednodijelni fluorofori koji se često koriste u istraživanjima.