पीसीआर की नियुक्ति और विधि का सिद्धांत। पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और इसके आवेदन

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तरीका पोलीमरेज श्रृंखला अभिक्रिया लगभग तीस साल पहले अमेरिकी वैज्ञानिक द्वारा खोला गया था कैरी मुलिस। तकनीक एक नैदानिक \u200b\u200bउपकरण के रूप में दवा में व्यापक है, और इसके सार में विशेष एंजाइम की मदद से डीएनए अनुभाग की प्रतिलिपि बनाने में शामिल है ( पोलीमर्स) टेस्ट ट्यूब में कृत्रिम तरीका।

इस विधि को किस क्षेत्र में लागू किया जाता है?

कॉपी डीएनए क्या है और यह दवा कैसे हो सकती है?
यह तकनीक आपको निम्न अनुमति देती है:

• चयन और क्लोन जीन।
• अनुवांशिक और संक्रामक रोगों का निदान करें।
• पितृत्व को परिभाषित करें। बच्चे ने आंशिक रूप से अपने जैविक माता-पिता से अनुवांशिक विशेषताओं को विरासत में पाया है, हालांकि, इसकी अपनी अनूठी अनुवांशिक पहचान है। उनके पास मूल जीन के समान कुछ जीन हैं - आपको रिश्तेदारी की स्थापना के बारे में बात करने की अनुमति देता है।

फोरेंसिक अभ्यास में पॉलिमरस श्रृंखला प्रतिक्रिया भी लागू की जाती है।

अपराध दृश्य में, कार्यवाही अनुवांशिक सामग्री के नमूने एकत्र करती है। इनमें शामिल हैं: बाल, लार, रक्त। इसके बाद, बहुलक प्रतिक्रिया की विधि के कारण, डीएनए को संदिग्ध की अनुवांशिक सामग्री के साथ नमूना की पहचान और तुलना की जा सकती है।

दवा प्रभावी रूप से एक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग करती है:

• पल्मोनोलॉजिकल अभ्यास में - निमोनिया, क्षय रोग की जीवाणु और वायरल प्रजातियों के भेदभाव के लिए।
• स्त्री रोग संबंधी और मूत्र संबंधी अभ्यास में - यूरेप्लाज्मोसिस, क्लैमिडिया, माइकोप्लाज्मा संक्रमण, गार्डनेरेलोसिस, हर्पस, गोनोरिया का निर्धारण करने के लिए।
• गैस्ट्रोएंटेरोलॉजिकल प्रैक्टिस में।
• हेमेटोलॉजी में - Onkovirus और Cytomegalovirus संक्रमण को निर्धारित करने के लिए।
• इस तरह के तेजी से निदान में संक्रामक रोग वायरल हेपेटाइटिस, डिप्थीरिया, साल्मोनेलोसिस की तरह।

वर्तमान में, संक्रामक बीमारियों के निदान में यह विधि सबसे आम है ( हेपेटाइटिस वायरल ईटियोलॉजी, एचआईवी, वेनरियल रोग, तपेदिक, टिक-जनित एन्सेफलाइटिस).

प्रतिक्रिया के दौरान क्या होता है?

प्रतिक्रिया ही रासायनिक रूप से सरल है। प्रतिक्रिया के लिए डीएनए का स्रोत रक्त, बाल, त्वचा का एक टुकड़ा इत्यादि की बूंद के रूप में कार्य कर सकता है। सिद्धांत रूप में, प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक अभिकर्मकों, एक परीक्षण ट्यूब, जैविक सामग्री का नमूना और एक गर्मी स्रोत की आवश्यकता होती है।

पॉलिमरसेस प्रतिक्रिया आपको संक्रमण की पहचान करने की अनुमति देती है, भले ही जैविक सामग्री के साथ नमूने में रोगगर के केवल एक या अधिक डीएनए अणु हों।

प्रतिक्रिया प्रवाह के दौरान, डीएनए polymerase एंजाइम के लिए धन्यवाद, दोगुना ( प्रतिकृति) डीएनए प्लॉट। Deoxyribonucleic एसिड खुद ( संक्षेप में डीएनए) आनुवंशिक जानकारी की सहायक कोशिकाओं को भंडारण और संचरण सुनिश्चित करना हमारे लिए महत्वपूर्ण है। डीएनए के पास एक प्रकार की सर्पिल है, जिसमें दोहराव वाले ब्लॉक होते हैं। ये ब्लॉक न्यूक्लियोटाइड बनाते हैं जो सबसे छोटे डीएनए कण होते हैं। न्यूक्लियोटाइड एमिनो एसिड से गठित होते हैं।

दोहराए गए चक्रों के दौरान डीएनए अनुभागों की प्रतिकृति की प्रक्रिया होती है। न केवल मूल डीएनए टुकड़ा को ऐसे चक्र में कॉपी किया जाता है, लेकिन पिछले प्रवर्धन चक्र में पहले से ही दोगुनी करने वाले उन टुकड़ों की प्रतिलिपि बनाई गई है। यह सब ज्यामितीय प्रगति की प्रक्रिया जैसा दिखता है।

मौजूद:

• प्राकृतिक प्रवर्धन ( यह डीएनए की प्रतिलिपि बनाने और प्रजनन की प्रक्रिया है), जो हमारे शरीर में होता है और एक निर्धारक, पूर्व निर्धारित प्रक्रिया है।
• कृत्रिम प्रवर्धन, जो बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया के कारण होता है। इस मामले में, प्रतिलिपि प्रक्रिया को नियंत्रित किया जाता है और आपको न्यूक्लिक एसिड के छोटे क्षेत्रों को भी दोगुना करने की अनुमति देता है।

प्रत्येक प्रतिलिपि चक्र को पूरा करने के बाद, न्यूक्लिक एसिड टुकड़ों की संख्या ज्यामितीय प्रगति में बढ़ जाती है। यही कारण है कि प्रक्रिया को "चेन रिएक्शन" कहा जाता है।

तीस-चालीस चक्र, टुकड़ों की संख्या कई अरब तक पहुंच जाती है।

प्रवर्धन के लिए कृत्रिम परिवेशीय। (कृत्रिम परिवेशीय) यह आवश्यक है कि बायोस्रियल में निदान करने के लिए लिया गया था, डीएनए का एक विशिष्ट विदेशी टुकड़ा मौजूद था ( यही है, डीएनए एक रोगी नहीं है, बल्कि कारक एजेंट है)। यदि निर्मित समाधान में कोई विशिष्ट खंड नहीं है - पॉलिमरस की कार्रवाई के तहत श्रृंखला प्रतिक्रिया नहीं जाएगी। यह पीसीआर की उच्च विशिष्टता के तथ्य को बताता है।

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स के चरण

1. अध्ययन के तहत सामग्री से, डीएनए प्रतिष्ठित है।
2. डीएनए को न्यूक्लियोटाइड से एक विशेष समाधान में जोड़ा जाता है।
3. डीएनए प्रोटीन लुढ़का के क्रम में, 90 95 डिग्री सेल्सियस के तापमान के लिए समाधान को गर्म करें।
4. तापमान को 60 डिग्री तक कम करें।
5. तापमान के तापमान को बढ़ाने के चक्रों को कम करते समय, न्यूक्लिक एसिड वर्गों की संख्या बढ़ जाती है।

6. इलेक्ट्रोफोरोसिस संचालित करके, परिणाम सारांशित किया गया है, और प्रतिक्रिया परिणामों की गणना की जाती है।

इस डायग्नोस्टिक्स के क्या फायदे हैं?

• सार्वभौमिकता: इस विधि के लिए, किसी भी न्यूक्लिक एसिड नमूने उपयुक्त हैं।
• उच्च विशिष्टता: कारक एजेंट में डीएनए श्रृंखलाओं के अद्वितीय अनुक्रम हैं, जो उनकी विशेषता हैं। इसलिए, बिताए गए पीसीआर के परिणाम विश्वसनीय होंगे, एक अन्य रोगजनक के जीनोम के साथ एक रोगजनक के जीन को भ्रमित करना असंभव है।
• एक भी कारक एजेंट अणु की उपस्थिति के प्रति संवेदनशीलता।

• अनुसंधान के लिए आवश्यक छोटी सामग्री। यहां तक \u200b\u200bकि रक्त की एक बूंद भी उपयुक्त है। परिणाम प्राप्त करने की क्षमता, नमूना की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करके, बाल चिकित्सा, नवजात, न्यूरोलॉजिकल अध्ययन, साथ ही साथ फोरेंसिक दवा के अभ्यास के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
• सुस्त, पुरानी संक्रमण को निर्धारित करने की संभावना, और न केवल तीव्र।
• कई रोगजनक संस्कृतियों को अन्य तकनीकों के साथ एक परीक्षण ट्यूब में खेती करना बहुत मुश्किल है, और पॉलिमरस प्रतिक्रिया वांछित मात्रा में गुणा संस्कृति की अनुमति देती है।

इस निदान के क्या नुकसान हैं?

• यदि कोई डीएनए न केवल एक जीवित रोगजनक है, बल्कि मृतक भी है - दोनों डीएनए का प्रवर्धन पीसीआर आयोजित करने के लिए सामग्री में होगा। तदनुसार, निदान के बाद उपचार को उचित रूप से नियुक्त किया जा सकता है। कुछ समय बाद, उपचार की प्रभावशीलता के नियंत्रण से गुजरना बेहतर होता है।
• सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति के लिए बढ़ी हुई संवेदनशीलता को किसी भी तरह से नुकसान भी माना जा सकता है। दरअसल, आमतौर पर रोगजनक माइक्रोफ्लोरा मानव शरीर में मौजूद होता है, यानी, ये सूक्ष्मजीव हैं जो आंतों में रहते हैं, पेट, अन्य आंतरिक अंग। ये सूक्ष्मजीव केवल कुछ प्रतिकूल परिस्थितियों के तहत मनुष्य को नुकसान पहुंचा सकते हैं - स्वच्छता आवश्यकताओं के साथ अनुपालन, दूषित पेयजल इत्यादि। पीसीआर तकनीक भी इन सूक्ष्मजीवों के डीएनए को बढ़ाती है, हालांकि वे पैथोलॉजी का नेतृत्व नहीं करते हैं।
• विभिन्न परीक्षण प्रणालियों का पीसीआर परिणाम दिखा सकता है जो एक-दूसरे से टूट जाएंगे। इस तकनीक के कई संशोधन हैं: " नेस्ट», « असममितीय», « उल्टे», « मात्रात्मक»पीसीआर और अन्य।

बैक्टीरिया की जेनेटिक्स। दूसरी कक्षाओं के लिए जानकारी।

पोलीमरेज श्रृंखला अभिक्रिया

पॉलिमरस चेन रिएक्शन एक विधि है जो विश्लेषण किए गए नमूने (जैविक सामग्री या शुद्ध संस्कृति सहित) में कुछ डीएनए अणुओं की मात्रा के एक से अधिक वृद्धि (प्रवर्धन) की अनुमति देती है।

माइक्रोबायोलॉजी में एक नैदानिक \u200b\u200bविधि के रूप में पीसीआर के मुख्य लाभ बहुत अधिक संवेदनशीलता हैं जो नमूने में रोगजनकों की अत्यधिक छोटी सांद्रता का पता लगाने, और कर-समायोज्य विशिष्टता, जो एक सामान्य, प्रजातियों या उप- पर रोगजनकों का पता लगाने या पहचानने की अनुमति देता है स्तर स्तर। पीसीआर की मुख्य कमी इसकी अत्यधिक उच्च संवेदनशीलता से होती है - छवियों को सकारात्मक नियंत्रण, एक और नमूना या पीसीआर उत्पाद से डीएनए को दूषित करना बहुत आसान होता है, जो झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया का कारण बनता है। यह उन परिस्थितियों पर कठोर प्रतिबंध लगाता है जिनमें पीसीआर मिश्रित होता है और तैयार किए गए पीसीआर उत्पादों के साथ काम किया जाता है।

पीसीआर का संचालन।प्रतिक्रिया मिश्रण निम्नलिखित घटकों वाली तैयार है:

अध्ययन के तहत नमूना से चयनित डीएनए,

बफर

एमजी 2 + आयन (एंजाइम काम के लिए आवश्यक),

दो प्राइमर एकल-फंसे हुए डीएनए अणुओं (18 से 24 न्यूक्लियोटाइड की लंबाई लंबाई) हैं, जो पता लगाने योग्य डीएनए अनुक्रम के विभिन्न सर्किट के पूरक सिरों हैं।

Deoxinucleotidtriphosphates का मिश्रण।

हीट-प्रतिरोधी डीएनए पॉलीमरेज़ (TAQ Polymerase अक्सर इस्तेमाल किया जाता है, से अलग किया जाता है थर्मस एक्वाटिकस।).

फिर यह प्रतिक्रिया मिश्रण एक एम्पलीफायर में रखा गया है, जो वास्तव में एक प्रोग्राम करने योग्य थर्मोस्टेट है। एम्पलीफायर में, 30-40 तापमान शिफ्ट चक्र किए जाते हैं। इन चक्रों में से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं (चित्र 1 देखें):

Denaturation (तापमान 94 डिग्री सेल्सियस) - विस्फोट हाइड्रोजन चेन, और डीएनए श्रृंखलाओं को अलग किया जाता है।

एनीलिंग प्राइमर्स (तापमान आमतौर पर लगभग 50-60 ओ सी) होता है - प्राइमर्स डीएनए सर्किट के सिरों तक शामिल होते हैं। सामान्य रूप से, जब तापमान कम हो जाता है, तो अध्ययन किए गए नमूने (पुनर्जागरण) से मूल डीएनए शुरू होने वाले सर्किट का पुनर्मिलन ऊर्जावान रूप से अधिक लाभदायक होता है, लेकिन डीएनए की एकाग्रता से अधिक परिमाण के कई आदेशों के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में प्राइमरों की एकाग्रता नमूना (कम से कम प्रारंभिक पीसीआर चक्रों पर), इसलिए प्राइमर एनीलिंग की प्रतिक्रिया तेजी से पुनर्जागरण डीएनए बहती है। प्राइमरों के पिघलने वाले तापमान (denaturation) के आधार पर एनीलिंग तापमान का चयन किया जाता है।

लम्बाई (तापमान आमतौर पर 72 डिग्री सेल्सियस होता है) - डीएनए पोलीमरेज ने प्राइमर्स को लंबी डीएनए श्रृंखलाओं के मैट्रिक्स के अनुसार पूरा किया। तापमान डीएनए पॉलिमरस के इष्टतम तापमान से मेल खाता है।

परिणामों का पता पार करने से पीसीआर सेट के विभिन्न संस्करणों में अलग है और "पीसीआर किस्मों" अनुभाग में वर्णित है।

पीसीआर स्पीकर

शुरुआती पीसीआर चक्रों में, दो-फंसे डीएनए अणुओं की संख्या, जिसका आकार प्राइमरों के स्थानों के बीच की दूरी से निर्धारित होता है, प्रत्येक चक्र के साथ दोगुना होता है। लंबे डीएनए अणुओं की एक छोटी संख्या भी गठित की जाती है, जिसे उपेक्षित किया जा सकता है (चित्र 2 देखें)।

इस प्रकार, शुरुआती चक्रों में, पीसीआर उत्पाद की मात्रा एम * 2 एन फॉर्मूला द्वारा वर्णित की जाती है, जहां एम नमूना में डीएनए की प्रारंभिक संख्या है, एन चक्रों की संख्या है। फिर प्रतिक्रिया पठार में जाती है। यह प्रतिक्रिया उत्पाद के संचय के कारण है, प्राइमरों और deoxynucleotidththrifoshath की एकाग्रता को कम करने के साथ-साथ पायरोफॉस्फेट की एकाग्रता को बढ़ाकर (चित्र 3 देखें)।

पीसीआर किस्में

सम्मेलन पीसीआर

इस अवतार में, पीसीआर प्रतिक्रिया करता है प्रतिक्रिया एक पूर्व निर्धारित संख्या चक्र (30-40) है, जिसके बाद इसका विश्लेषण किया जाता है कि प्रतिक्रिया मिश्रण में डबल-चेन डीएनए अणुओं का संचय हुआ है या नहीं।

डायग्नोस्टिक्स की विधि के रूप में उपयोग किए जाने पर पीसीआर फॉर्मूलेशन का यह संस्करण गुणात्मक विधि है। एक सकारात्मक प्रतिक्रिया नमूना में वांछित डीएनए अणुओं की कम से कम ट्रेस मात्रा की उपस्थिति को इंगित करती है। नकारात्मक प्रतिक्रिया उनकी अनुपस्थिति को इंगित करती है। नमूना में मूल डीएनए अणुओं की सामग्री का मात्रात्मक मूल्यांकन पठार की प्रतिक्रिया के कारण असंभव है।

उत्पाद की उपस्थिति का पता लगाने का मुख्य तरीका agarose या polyacrylamide जेल में electrophoresis है। पीसीआर उत्पादों को उनके आणविक भार के अनुसार विद्युत क्षेत्र की कार्रवाई के तहत जेल में बांटा गया है। एक अंतराल डाई जेल में जोड़ा जाता है (डबल-फंसे डीएनए से जुड़ी स्थिति में फ्लोरोसेंट - अक्सर ब्रोमाइन एथिडियम)। इस प्रकार, जब पराबैंगनी के साथ विकिरणित होता है, तो आवश्यक आणविक भार के डीएनए से संबंधित एक पट्टी की उपस्थिति या अनुपस्थिति को देखना संभव होगा। डायग्नोस्टिक उद्देश्यों के लिए पीसीआर का संचालन करते समय, प्रतिक्रिया का सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण हमेशा रखा जाता है, जिसके साथ नमूने की तुलना की जाती है (चित्र 4 देखें)।

पीसीआर रीयल-टाइम

इस अवतार में, पीसीआर प्रतिक्रिया प्रवाह में प्रतिक्रिया मिश्रण में लगातार पीसीआर उत्पाद की मात्रा को निष्पादित करता है। यह हमें एक प्रतिक्रिया वक्र बनाने की अनुमति देता है (चित्र 3 देखें) और, इसके आधार पर, नमूने में वांछित डीएनए अणुओं की संख्या की गणना करें।

वास्तविक समय में पीसीआर के प्रकारों में से एक - इंटरक्लटेरेंट का उपयोग करके, जिसे सीधे प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है (सिब्रग्रीन का अक्सर उपयोग किया जाता है)। एक और प्रकार - फ्लोरोसेंट जांच के प्रकारों में से एक का उपयोग करके, पीसीआर उत्पाद के अंदर एक खंड के लिए बाध्यकारी, जो पहचान की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए संभव बनाता है (चित्र 5 देखें)। प्रवाह प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया प्रवाह के दौरान सीधे उपकरण में होती है ।

मात्रात्मक पहचान की संभावना के अलावा, पारंपरिक की तुलना में वास्तविक समय में पीसीआर के अन्य फायदे हैं। पीसीआर का यह संस्करण सरल, तेज़ है, और पीसीआर उत्पादों के साथ ट्यूबों को खोजने की भी आवश्यकता नहीं है, जो अन्य नमूने के प्रदूषण की संभावना को कम कर देता है। मुख्य दोष सामान्य की तुलना में फ्लोरोसेंस की पहचान की एकीकृत संभावना के साथ एम्पलीफायर का उच्च मूल्य है।

डिजिटल मात्रात्मक पीसीआर

एक नया, महंगा और अब तक एक छोटा फैलाने वाला संस्करण, जो आपको नमूना में डीएनए की मात्रा को सटीक रूप से निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस अवतार में, एक फ्लोरोसेंट डाई युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण को बड़ी संख्या में सूक्ष्म मात्रा में विभाजित किया जाता है (उदाहरण के लिए, पायस में बूंदों)। पीसीआर प्रवाह का विश्लेषण करने के बाद, बूंदों के हिस्से में प्रतिक्रिया सकारात्मक थी और तदनुसार, फ्लोरोसेंस मनाया जाता है। यह हिस्सा नमूना में वांछित डीएनए अणुओं की संख्या के आनुपातिक होगा।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ पीसीआर

इस मामले में, एक विशेष संस्करण पीसीआर से पहले, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (डीएनए में आरएनए) एक Revertase एंजाइम का उपयोग करके किया जाता है। इस प्रकार, यह विधि आपको आरएनए अणुओं का उच्च गुणवत्ता या मात्रात्मक पहचान करने की अनुमति देती है। इसका उपयोग आरएनए युक्त वायरस का पता लगाने या जीन या किसी अन्य के प्रतिलेखन (एमआरएनए की संख्या) के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

चित्र 1। पीसीआर के चरण। लाल रंग को चिह्नित प्राइमर्स।

चित्र 2।पीसीआर के दौरान प्राइमर्स द्वारा सीमित डबल-चेन डीएनए अणुओं का संचय।

चित्र तीन।नमूना में वांछित डीएनए अणुओं की विभिन्न प्रारंभिक सांद्रता पर पीसीआर प्रतिक्रिया की गतिशीलता। (ए) - उच्चतम एकाग्रता (बी) - इंटरमीडिएट एकाग्रता (बी) - सबसे छोटी एकाग्रता

चित्रा 4।पीसीआर उत्पादों का अग्रोमिक इलेक्ट्रोफोरोसिस। के + - सकारात्मक नियंत्रण (स्नोरल डीएनए मौजूद है)। 1-7 - अध्ययन किए गए नमूने (जिनमें से 1-2 सकारात्मक हैं, 3-7 नकारात्मक हैं)। के - नकारात्मक नियंत्रण (वांछित डीएनए स्पष्ट रूप से गायब है)। कई मामलों में, लक्षित उत्पाद के अलावा, हल्का गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद दिखाई दे रहे हैं (प्राइमर डिमर्स)।

चित्रा 5।रीयल-टाइम पीसीआर का उपयोग करते समय पहचान के लिए तरीके। (ए) - इंटरक्लिटिंग डाई - फ्लोरोसेंट्स दो-फंसे डीएनए (बी) - तकमान - TAQMAN - फ्लोरोसेंस जांच तब होती है जब फ्लोरोमेरस डीएनए जांच फ्लोरोफोर और विघटन के अलगाव के कारण 5'-3 'एंडोन्यूक्लीज़ गतिविधि के साथ छिपी हुई होती है। (सी) - आणविककोश - फ्लोरोसेंस जांच तब उत्पन्न होती है जब फ्लोरोफोर की स्थानिक दूरी के कारण लक्ष्य खंड के साथ जांच का संकरण होता है और थकावट (जी) - जांच लाइटसाइक्लर - स्वीकार्य प्रतिदीपन जांच के संकरण (स्वीकार्यकर्ता युक्त) में होता है और दाता) अनुनाद फ्लोरोसेंस ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) के कारण लक्ष्य खंड के साथ।

नोबेल पुरस्कार मिला।

हीटिंग-शीतलन के प्रत्येक चक्र के बाद विधि के उपयोग की शुरुआत में, प्रतिक्रिया मिश्रण में डीएनए पॉलीमरेज़ जोड़ना आवश्यक था, क्योंकि यह निष्क्रिय था उच्च तापमानडीएनए सर्पिल चेन को अलग करने के लिए आवश्यक है। प्रतिक्रिया प्रक्रिया अपेक्षाकृत अप्रभावी थी, बहुत समय और एंजाइम की मांग की। 1 9 86 में, पॉलिमरस श्रृंखला प्रतिक्रिया की विधि में काफी सुधार हुआ था। थर्मोफिलिक बैक्टीरिया से डीएनए बहुलक का उपयोग करने का प्रस्ताव दिया गया था। ये एंजाइम थर्मोस्टेबल थे और कई प्रतिक्रिया चक्रों का सामना करने में सक्षम थे। उनके उपयोग ने पीसीआर को सरल और स्वचालित करना संभव बना दिया। पहले थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमेराज़ में से एक बैक्टीरिया से हाइलाइट किया गया था थर्मस एक्वाटिकस। और नामित Taq।- पॉलीमिया। इस बहुलक की कमी यह है कि एक गलत न्यूक्लियोटाइड बनाने की संभावना काफी अधिक है, क्योंकि इस एंजाइम में त्रुटि सुधार तंत्र (3 "→ 5" exonuclease गतिविधि नहीं है)। पोलीमर्स पीएफयू। तथा Pwo।आर्की से चयनित एक तंत्र है, उनके उपयोग में डीएनए में उत्परिवर्तन की संख्या को काफी कम कर दिया जाता है, लेकिन उनकी गति (सबूत) इससे कम है Taq।। अब मिश्रण लागू करें Taq। तथा पीएफयू।एक ही समय में उच्च पॉलिमरराइजेशन दर और उच्च प्रतिलिपि सटीकता प्राप्त करने के लिए।

आविष्कार के इस समय, कैरी मुलिस विधि ने सिंथेटिक रसायनज्ञ (यह ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषित किया गया था, जिसे सीटस कॉर्पोरेशन कंपनी में जीनोमिक डीएनए के साथ हाइब्रिडाइजेशन द्वारा प्वाइंट म्यूटेशन का पता लगाने के लिए किया गया था), जो पीसीआर विधि भी पेटेंट करता है। 1 99 2 में, ज़ेटस ने विधि का अधिकार और उपयोग के लिए पेटेंट को बेच दिया Taq।- $ 300 मिलियन के लिए कंपनी होफमैन-ला रोश के बहुलक। हालांकि, यह पता चला Taq।- पॉलिमेराज़ा को सोवियत जैव रसायनविदों ए काल्टेडिन, ए स्लीउसरेंको और एस रोडसेटस्की द्वारा 1 9 80 में और इस सोवियत प्रकाशन से 4 साल पहले की विशेषता थी, यानी, 1 9 76 में, अमेरिकी बायोकेमिस्ट एलिस चियान, डेविड बीडीगर और जॉन एम। ट्रेला। इस संबंध में, प्रोमेगा (प्रोमेगा) की कंपनी ने रोश को इस एंजाइम के अनन्य अधिकारों से इनकार करने के लिए मजबूर करने की कोशिश की। पीसीआर विधि के लिए अमेरिकी पेटेंट मार्च 2005 में समाप्त हो गया है

पीसीआर

यह विधि कृत्रिम स्थितियों में एंजाइमों की मदद से डीएनए के एक निश्चित खंड की एकाधिक चुनावी प्रतिलिपि पर आधारित है ( कृत्रिम परिवेशीय।)। साथ ही, केवल साइट कॉपी की जाती है, जो निर्दिष्ट शर्तों को पूरा करती है, और केवल तभी यदि यह अध्ययन के तहत नमूने में मौजूद है। जीएनए में डीएनए के प्रवर्धन के विपरीत, (प्रतिकृति), पीसीआर की मदद से, अपेक्षाकृत कम डीएनए अनुभागों को बढ़ाया जाता है। सामान्य पीसीआर प्रक्रिया में, प्रतिलिपि डीएनए अनुभागों की लंबाई 3,000 से अधिक आधार जोड़े (3 केबीपी) नहीं है। विभिन्न बहुलक के मिश्रण की मदद से, additives और कुछ स्थितियों के तहत, पीसीआर खंड की लंबाई न्यूक्लियोटाइड के 20-40 हजार जोड़े तक पहुंच सकते हैं। यह अभी भी यूकेरियोटिक सेल के गुणसूत्र डीएनए की लंबाई से काफी कम है। उदाहरण के लिए, एक मानव जीनोम में लगभग 3 अरब बेस जोड़े होते हैं।

प्रतिक्रिया घटकों

पीसीआर के लिए सबसे सरल मामले में, निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता है:

• डीएनए मैट्रिक्सजिसमें डीएनए भाग शामिल है जो बढ़ाने के लिए आवश्यक है।
• दो प्राइमरवांछित डीएनए टुकड़ा के विभिन्न सर्किट के विपरीत सिरों द्वारा पूरक।
• थर्मास्टाइबल डीएनए पॉलिमरेज़ - एक एंजाइम जो डीएनए बहुलक प्रतिक्रिया उत्प्रेरित करता है। पीसीआर में उपयोग के लिए पॉलिमरस को लंबे समय तक उच्च तापमान पर गतिविधि बनाए रखना चाहिए, इसलिए वे थर्मोफाइल से अलग एंजाइमों का उपयोग करते हैं - थर्मस एक्वाटिकस। (TAQ POLYMERASE), पायरोकोकस फ़ुरियोसस (PFU Polymerase) पायरोकोकस वोसेई। (Pwo polymerase) और अन्य।
• Deoxyribonuclastrifhathathat (डीएटीपी, डीजीटीपी, डीसीटीपी, डीटीटीपी)।
• पॉलिमरस के संचालन के लिए एमजी 2+ आयन आवश्यक हैं।
• उभयरोधी घोलआवश्यक प्रतिक्रिया शर्तों को प्रदान करना - पीएच, आयनिक शक्ति बल। लवण, बोवाइन मट्ठा एल्बमिन शामिल हैं।

प्रतिक्रिया मिश्रण की वाष्पीकरण से बचने के लिए, उच्च उबलते तेल ट्यूब में जोड़ा जाता है, उदाहरण के लिए, vaseline। यदि एक एम्पलीफायर को गर्म ढक्कन के साथ उपयोग किया जाता है, तो इसे करने की आवश्यकता नहीं है।

पायरोफॉस्फेटस जोड़ना पीसीआर प्रतिक्रिया की उपज में वृद्धि कर सकता है। यह एंजाइम डायोफॉस्फेट के हाइड्रोलिसिस, डीएनए की बढ़ती श्रृंखला के लिए, ऑर्थोफॉस्फेट के लिए न्यूक्लियोट्रिप्ट्रिपोस्फास्ट के संलग्नक का साइड उत्पाद उत्प्रेरित करता है। पायरोफॉस्फेट पीसीआर प्रतिक्रिया को रोक सकता है।

प्राइमिमर्स

पीसीआर की विशिष्टता मैट्रिक्स और प्राइमर्स, 18-30 बेस के लघु सिंथेटिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के बीच पूरक परिसरों के गठन पर आधारित है। प्रत्येक प्राइमर दो-श्रृंखला मैट्रिक्स की श्रृंखला में से एक के पूरक हैं और प्रवर्धित क्षेत्र की शुरुआत और अंत को सीमित करते हैं।

प्राइमर (एनीलिंग) के साथ मैट्रिक्स के संकरण के बाद, उत्तरार्द्ध मैट्रिक्स की पूरक श्रृंखला (देखें) के संश्लेषण में डीएनए पॉलीमरेज़ के लिए एक बीज के रूप में कार्य करता है।

प्राइमर्स की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता प्राइमर-मैट्रिक्स कॉम्प्लेक्स का पिघलने बिंदु (टी एम) है।

टी एम तापमान है जिस पर डीएनए मैट्रिसेस का आधा एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर के साथ एक परिसर बनाता है। एक छोटे oligonucleotide (और लंबे डीएनए टुकड़ों के लिए) के लिए औसत गणना फॉर्मूला टी एम, के + और डीएमएसओ आयनों की एकाग्रता को ध्यान में रखते हुए:

जहां एल प्राइमर में न्यूक्लियोटाइड की संख्या है, के + पोटेशियम आयनों की दाढ़ी एकाग्रता है, जी + सी - सभी गुआनिन और साइटोसिन का योग है।

प्राइमर या एनीलिंग तापमान की लंबाई और न्यूक्लियोटाइड संरचना के गलत चयन के मामले में, मैट्रिक्स डीएनए के अन्य हिस्सों के साथ आंशिक रूप से पूरक परिसरों का निर्माण करना संभव है, जो गैर-विशिष्ट उत्पादों का कारण बन सकता है। पिघलने बिंदु की ऊपरी सीमा बहुलक के इष्टतम तापमान तक सीमित है, जिसकी गतिविधि 80 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर गिरती है।

प्राइमर्स चुनते समय, निम्नलिखित मानदंडों का पालन करना वांछनीय है:

एम्पलीफायर

अंजीर। एक: पीसीआर के लिए एम्पलीफायर

पीसीआर एक एम्पलीफायर में किया जाता है - एक उपकरण आवधिक शीतलन और हीटिंग ट्यूब प्रदान करता है, आमतौर पर कम से कम 0.1 डिग्री सेल्सियस की सटीकता के साथ। आधुनिक एम्पलीफायर आपको जटिल कार्यक्रमों को निर्दिष्ट करने की अनुमति देता है, जिसमें "हॉट स्टार्ट", टचडाउन पीसीआर (नीचे देखें) और 4 डिग्री सेल्सियस पर एम्पलीफाइड अणुओं के बाद के भंडारण की संभावना शामिल है। वास्तविक समय में पीसीआर के लिए, फ्लोरोसेंट डिटेक्टर से सुसज्जित डिवाइस जारी किए जाते हैं। एक स्वचालित ढक्कन और माइक्रोप्रेट के लिए एक डिब्बे के साथ उपकरण भी हैं, जो आपको उन्हें स्वचालित सिस्टम में एम्बेड करने की अनुमति देता है।

रिएक्शन कोर्स

फोटोग्राफी जेल युक्त मार्कर डीएनए (पहला और अंतिम स्लॉट) और पीसीआर उत्पाद युक्त

आम तौर पर, पीसीआर के दौरान, 20-35 चक्र किए जाते हैं, जिनमें से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं (चित्र 2)।

विकृतीकरण

दो-फंसे हुए डीएनए मैट्रिक्स को 94-96 डिग्री सेल्सियस (या 98 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाया जाता है यदि एक विशेष थर्मोस्टेबल पॉलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है) 0.5-2 मिनट से 0.5-2 मिनट ताकि डीएनए चेन अलग हो जाएं। इस चरण को कहा जाता है विकृतीकरणचूंकि हाइड्रोजन बंधन दो डीएनए श्रृंखलाओं के बीच नष्ट हो जाते हैं। कभी-कभी पहले चक्र (पॉलिमरेज़ जोड़ने से पहले) से पहले, प्रतिक्रिया मिश्रण का प्रारंभिक हीटिंग मैट्रिक्स और प्राइमरों की पूर्ण denaturation के लिए 2-3 मिनट के लिए किया जाता है। इस रिसेप्शन को कहा जाता है ठोस शुरुआतयह आपको गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादों की संख्या को कम करने की अनुमति देता है।

एनीलिंग

जब सर्किट अलग हो जाते थे, तो तापमान कम हो जाता है ताकि प्राइमर एकल-फंसे हुए मैट्रिक्स से संपर्क कर सकें। इस चरण को कहा जाता है एनीलिंग। एनीलिंग तापमान प्राइमरों की संरचना पर निर्भर करता है और आमतौर पर प्राइमरों के पिघलने बिंदु के बराबर चुना जाता है। एनीलिंग तापमान की गलत पसंद एक मैट्रिक्स (एक अतिरंजित तापमान पर) के साथ प्राइमरों की खराब बाध्यकारी होती है, या गलत जगह पर बाध्यकारी और गैर-विशिष्ट उत्पादों (कम तापमान पर) की उपस्थिति होती है। एनीलिंग चरण का समय 30 टुकड़े है, साथ ही, इस समय के दौरान, पॉलिमरम्स पहले से ही कई सौ न्यूक्लियोटाइड को संश्लेषित करने में कामयाब रहे हैं। इसलिए, 60 डिग्री सेल्सियस से ऊपर एक पिघलने बिंदु के साथ प्राइमरों का चयन करने और 60-72 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग और लम्बाई करने के लिए अनुशंसा की जाती है।

लम्बाई

डीएनए पॉलीमेरस एक बीज के रूप में प्राइमर का उपयोग कर मैट्रिक्स सर्किट की प्रतिलिपि बनाता है। यह एक मंच है लम्बाई। पॉलिमरस ने प्राइमर के 3 "--कॉन्टाइज़र से दूसरी श्रृंखला के संश्लेषण की शुरुआत की, जिसने मैट्रिक्स से संपर्क किया, और मैट्रिक्स के साथ चलता है, 5" से 3 "अंत की दिशा में नई श्रृंखला को संश्लेषित करता है। लम्बाई का तापमान बहुलक पर निर्भर करता है। अक्सर उपयोग किया जाने वाला TAQ पॉलिमरियन और पीएफयू 72 डिग्री सेल्सियस पर सबसे सक्रिय होते हैं। लम्बाई का समय डीएनए पॉलीमरेज़ के प्रकार और प्रवर्धित टुकड़ा की लंबाई पर निर्भर करता है। आमतौर पर, लम्बाई का समय एक के बराबर होता है प्रत्येक हजार बेस जोड़े के लिए मिनट। सभी चक्रों के अंत के बाद, अक्सर एक अतिरिक्त कदम होता है अंतिम लम्बाईसभी एकल-श्रृंखला के टुकड़ों को पूरा करने के लिए। यह चरण 7-10 मिनट तक रहता है।

अंजीर। 2।: पहले पीसीआर चक्र का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (1) 94-96 डिग्री सेल्सियस पर denaturation। (2) 68 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग (उदाहरण के लिए)। (3) 72 डिग्री सेल्सियस (पी \u003d polymerase) पर लम्बाई। (4) पहला चक्र पूरा हो गया है। दोनों प्राप्त डीएनए चेन अगले चक्र के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में कार्य करते हैं, इसलिए प्रत्येक चक्र युगल के दौरान मैट्रिक्स डीएनए की मात्रा

एक विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा (प्राइमर्स द्वारा बाध्य) सैद्धांतिक रूप से 2 एन -2 एन के अनुपात में बढ़ जाती है, जहां एन प्रतिक्रिया चक्रों की संख्या है। वास्तव में, प्रत्येक चक्र की प्रभावशीलता 100% से कम हो सकती है, इसलिए, वास्तविकता पी ~ (1 + ई) एन में, जहां पी उत्पाद की मात्रा है, ई चक्र की औसत दक्षता है।

डीएनए की "लंबी" प्रतियों की संख्या भी बढ़ रही है, लेकिन रैखिक रूप से, एक विशिष्ट खंड प्रतिक्रिया उत्पादों में प्रभुत्व है।

ज्यामितीय प्रगति में वांछित उत्पाद की वृद्धि अभिकर्मकों की संख्या, अवरोधकों की उपस्थिति, उप-उत्पादों के गठन से सीमित है। प्रतिक्रिया के अंतिम चक्र पर, विकास धीमा हो जाता है, इसे "पठार प्रभाव" कहा जाता है।

पीसीआर किस्में

• नेस्टेड पीसीआर (नेस्टेड पीसीआर (इंग्लैंड)) - इसका उपयोग प्रतिक्रिया के उप-उत्पादों की संख्या को कम करने के लिए किया जाता है। प्राइमर्स के दो जोड़े का प्रयोग करें और लगातार दो प्रतिक्रियाएं संचालित करें। प्राइमर्स की दूसरी जोड़ी पहली प्रतिक्रिया के उत्पाद के भीतर डीएनए अनुभाग को बढ़ाती है।
• उलटा पीसीआर (उलटा पीसीआर (अंग्रेजी)) - यदि वांछित अनुक्रम के अंदर केवल एक छोटा सा हिस्सा जाना जाता है तो इसका उपयोग किया जाता है। यह विधि विशेष रूप से उपयोगी होती है जब जीनोम में डीएनए डालने के बाद आसन्न अनुक्रमों को निर्धारित करना आवश्यक होता है। उलटा पीसीआर के कार्यान्वयन के लिए, अंशों (बंधन) के बाद के चक्र के साथ कई काटने वाले डीएनए प्रतिबंध किए जाते हैं। नतीजतन, प्रसिद्ध टुकड़े एक अज्ञात खंड के दोनों सिरों पर हैं, जिसके बाद पीसीआर सामान्य रूप से किया जा सकता है।
• रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ पीसीआर (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, आरटी-पीसीआर (इंग्लैंड)) - आरएनए लाइब्रेरी से ज्ञात अनुक्रम को बढ़ाने, चयन करने या पहचानने के लिए उपयोग किया जाता है। सामान्य पीसीआर से पहले, एक एकल फंसे हुए डीएनए अणु का संश्लेषण एमआरएनए मैट्रिक्स पर एक पुनरावृत्ति के साथ किया गया था और एक एकल श्रृंखला सीडीएनए प्राप्त किया जाता है, जिसे पीसीआर के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में उपयोग किया जाता है। यह विधि अक्सर यह निर्धारित करती है कि जीन डेटा कहां और कब व्यक्त किया जाता है।
• असममित पीसीआर (इंग्लैंड। असममित पीसीआर।) - यह मूल डीएनए की श्रृंखला में से एक को बढ़ाने के लिए आवश्यक होने पर किया जाता है। अनुक्रमण और हाइब्रिडाइजेशन विश्लेषण के कुछ तरीकों में उपयोग किया जाता है। पीसीआर सामान्य रूप से किया जाता है, सिवाय इसके कि प्राइमर्स में से एक को बड़ी अतिरिक्त में लिया जाता है। इस विधि का संशोधन अंग्रेजी है। एल कान में-ए। फटर-टी उसने-इ। xponential- पीसीआर। (देर से पीसीआर), जिसमें प्राइमरों का उपयोग विभिन्न सांद्रता के साथ किया जाता है, और कम एकाग्रता प्राइमर को उच्च सांद्रता प्राइमर की तुलना में उच्च (पिघलने वाले तापमान) के साथ चुना जाता है। पीसीआर उच्च एनीलिंग तापमान पर किया जाता है, जिससे पूरे चक्र में प्रतिक्रिया दक्षता को बनाए रखना संभव है।
• मात्रात्मक पीसीआर (मात्रात्मक पीसीआर, क्यू-पीसीआर (अंग्रेजी)) या पीसीआर रीयल-टाइम - प्रत्येक प्रतिक्रिया चक्र में विशिष्ट पीसीआर उत्पाद की मात्रा के माप की स्वचालित रूप से निगरानी करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस विधि में, फ्लोरोसेंट लेबल वाले प्राइमर या डीएनए जांच का उपयोग प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा को सटीक रूप से मापने के लिए किया जाता है क्योंकि इसे जमा किया जाता है; या एक फ्लोरोसेंट इंटरक्लिंग डाई का उपयोग किया जाता है SYBR ग्रीन I. जो डबल-फंसे डीएनए से बांधता है। SYBR ग्रीन I. विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच या प्राइमरों का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय पीसीआर के दौरान पीसीआर उत्पादों का पता लगाने और मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक सरल और आर्थिक विकल्प प्रदान करता है। प्रवर्धन डाई के दौरान SYBR ग्रीन I. डीएनए पीसीआर उत्पादों के एक छोटे से नाली में एम्बेड करें और एक नीले लेजर के साथ विकिरण करते समय फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ एक असंबद्ध डाई की तुलना में मजबूत खाता है। SYBR ग्रीन I. वास्तविक समय पीसीआर के लिए तिथि के लिए ज्ञात सभी उपकरणों के साथ संगत। के लिए अधिकतम अवशोषण SYBR ग्रीन I. 494 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर स्थित है। मुख्य के अलावा, डाई स्पेक्ट्रम में दो छोटे अतिरिक्त अवशोषण मैक्सिमा - 2 9 0 एनएम और 380 एनएम पर हैं। अधिकतम उत्सर्जन SYBR ग्रीन I. 521 एनएम (हरा) की तरंग दैर्ध्य पर स्थित है।
• स्टेप पीसीआर (टचडाउन पीसीआर (अंग्रेजी)) - इस दृष्टिकोण की मदद से गैर-विशिष्ट प्राइमर बाध्यकारी के प्रभाव को कम करें। पहले चक्र इष्टतम एनीलिंग तापमान के ऊपर तापमान पर किए जाते हैं, फिर प्रत्येक कुछ चक्र घाटी तापमान धीरे-धीरे इष्टतम हो जाते हैं। यह प्राइमर हाइब्रिडिज्ड के लिए अपनी सभी लंबाई की पूरक श्रृंखला के साथ किया जाता है; जबकि इष्टतम एनीलिंग तापमान के साथ, प्राइमर आंशिक रूप से पूरक श्रृंखला के साथ संकरित है। जीनोमिक डीएनए पर प्राइमर का आंशिक संकरण गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की ओर जाता है, यदि प्राइमर के लिए कई बाध्यकारी साइटें हैं। ज्यादातर मामलों में, पहले दस पीसीआर चक्र 72-75 डिग्री सेल्सियस के एक एनीलिंग तापमान पर किए जा सकते हैं, और फिर तुरंत इष्टतम को कम कर सकते हैं, उदाहरण के लिए 60-65 डिग्री सेल्सियस तक।
• आणविक उपनिवेशों की विधि (जेल, ईएनजी में पीसीआर। कॉलोनी - पीसीआर कॉलोनी) - एक्रिलमाइड जेल सतह पर सभी पीसीआर घटकों के साथ polymerized है और पीसीआर संचालन। विश्लेषण डीएनए युक्त बिंदुओं पर, प्रवर्धन आणविक उपनिवेशों के गठन के साथ होता है।
• सीडीएनए के सिरों के त्वरित प्रवर्धन के साथ पीसीआर (इंग्लैंड। सीडीएनए समाप्त, रेस-पीसीआर का रैपिड एपलाइटिफिकेशन ).
• पीसीआर लंबे टुकड़ों (इंग्लैंड। लंबी दूरी के पीसीआर) - विस्तारित डीएनए अनुभागों (10 हजार और अधिक आधार) को बढ़ाने के लिए पीसीआर का संशोधन। दो बहुलक का मिश्रण उपयोग किया जाता है, जिनमें से एक उच्च प्रमाण के साथ एक ताक बहुलक है (यानी, एक पास में डीएनए लंबी श्रृंखला को संश्लेषित करने में सक्षम है), और दूसरा - डीएनए पॉलिमरस 3 "-5" एक्सोन्यूक्लीज गतिविधि के साथ है आमतौर पर पीएफयू polymerase। पहले द्वारा किए गए त्रुटियों को समायोजित करने के लिए दूसरा पॉलिमरस आवश्यक है, क्योंकि यदि पूरक न्यूक्लियोटाइड नहीं जोड़ा गया है तो Taq Polymerase डीएनए के संश्लेषण को रोकता है। यह गैर-पूरक न्यूक्लियोटाइड पीएफयू पॉलिमरस को हटा देता है। Polymeraz का मिश्रण 50: 1 या 100: 1 से भी कम के संबंध में लिया जाता है, जहां Taq Polymerase पीएफयू polymerase के सापेक्ष 25-100 गुना अधिक लेता है।
• रैपड। (इंग्लैंड। पॉलिमॉर्फिक डीएनए का यादृच्छिक प्रवर्धन ), पॉलिमॉर्फिक डीएनए के यादृच्छिक प्रवर्धन के साथ पीसीआर का उपयोग किया जाता है जब आनुवंशिक अनुक्रम पर संयोजन के जीवों के बीच अंतर करना आवश्यक होता है, उदाहरण के लिए, खेती के पौधों की विभिन्न किस्मों, कुत्तों की नस्लों या निकट-अच्छे सूक्ष्मजीवों। इस विधि में, आमतौर पर एक छोटे आकार के प्राइमर का उपयोग किया जाता है (लगभग 10 पी।)। यह प्राइमर अध्ययन जीवों की यादृच्छिक डीएनए साइटों द्वारा आंशिक रूप से पूरक होगा। शर्तों का चयन (प्राइमर की लंबाई, इसकी संरचना, तापमान इत्यादि), दो जीवों के लिए पीसीआर पेंटिंग्स में संतोषजनक मतभेद प्राप्त करना संभव है।
• विशिष्ट पीसीआर (इंग्लैंड। समूह-विशिष्ट पीसीआर) - इन अनुक्रमों के लिए कंज़र्वेटिव प्राइमरों का उपयोग करके, एक या विभिन्न प्रजातियों के बीच संबंधित अनुक्रमों के लिए पीसीआर। उदाहरण के लिए, रिबोसोमल के सार्वभौमिक प्राइमरों का चयन 18s। तथा 26s। प्रजाति-विशिष्ट इंटरजेनिक स्पेसर के प्रवर्धन के लिए जीन: जीन का अनुक्रम 18s। तथा 26s। प्रजातियों के बीच रूढ़िवादी, इसलिए इन जीनों के बीच पीसीआर सभी अध्ययन प्रजातियों के लिए आयोजित किया जाएगा। विपरीत विधि है - अद्वितीय पीसीआर (इंग्लैंड। अद्वितीय पीसीआर), जिसमें कार्य संबंधित अनुक्रमों के बीच केवल एक विशिष्ट अनुक्रम को बढ़ाने के लिए प्राइमरों का चयन करने में शामिल होता है।
• गर्म शुरुआत का उपयोग कर पीसीआर (इंग्लैंड। हॉट-स्टार्ट पीसीआर) - एक डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग कर पीसीआर का संशोधन, जिसमें पॉलीमेरस गतिविधि एंटीबॉडी या एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर अवरुद्ध हो जाती है जो एंटीबॉडी जैसे एंटीबॉडी जैसे छोटे अणुओं का अनुकरण करती है, जो कि पीसीआर में पहली विकृति की प्रतिक्रिया के समय है। आम तौर पर पहली denaturation 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए किया जाता है।
• वर्चुअल पीसीआर (सिलिको पीसीआर में अंग्रेजी, डिजिटल पीसीआर, इलेक्ट्रॉनिक पीसीआर, ई-पीसीआर) - जीनोम के डीएनए के डीएनए के संभावित प्रवर्धन की भविष्यवाणी करने के लिए प्राइमर्स (या डीएनए जांच) अनुक्रमों की सूची का उपयोग करके सैद्धांतिक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया के कंप्यूटर विश्लेषण की गणितीय विधि अध्ययन, गुणसूत्र, अंगूठी डीएनए या कोई अन्य डीएनए साजिश।

यदि मैट्रिक्स के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को आंशिक रूप से या अज्ञात बिल्कुल भी जाना जाता है, तो आप उपयोग कर सकते हैं पतित प्राइमर्सजिनमें से अनुक्रम में अपमानजनक स्थिति होती है जिसमें कोई भी आधार स्थित हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्राइमर अनुक्रम इस तरह हो सकता है: ... एथ ...जहां एन - ए, टी या एस।

पीसीआर आवेदन

पीसीआर का उपयोग कई क्षेत्रों में विश्लेषण और वैज्ञानिक प्रयोगों में किया जाता है।

अपराधी

पीसीआर का उपयोग तथाकथित "जेनेटिक फिंगरप्रिंट" की तुलना करने के लिए किया जाता है। हमें अपराध दृश्य से आनुवांशिक सामग्री का नमूना चाहिए - रक्त, लार, शुक्राणु, बाल इत्यादि। इसकी तुलना संदिग्ध की अनुवांशिक सामग्री से की जाती है। काफी कम संख्या में डीएनए, सैद्धांतिक रूप से - एक प्रति। डीएनए टुकड़ों में विभाजित, फिर पीसीआर का उपयोग करके बढ़ाया। टुकड़ों को डीएनए इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा अलग किया जाता है। डीएनए बैंड के परिणामस्वरूप पैटर्न और कहा जाता है आनुवंशिक फिंगरप्रिंट (इंग्लैंड। आनुवंशिक फिंगरप्रिंट।).

पितृत्व स्थापना

अंजीर। 3।: पीसीआर द्वारा बढ़ाया डीएनए टुकड़ों के इलेक्ट्रोफोरोसिस के परिणाम। (1) पिता। (2) बेबी। (3) माँ। बच्चे ने माता-पिता दोनों के अनुवांशिक छाप की कुछ विशेषताओं को विरासत में मिला, जिसने एक नया, अद्वितीय छाप दिया।

हालांकि "जेनेटिक फिंगरप्रिंट" अद्वितीय हैं (सिंगल-टाइम जुड़वां के मामले के अपवाद के साथ), रिश्तों को कई ऐसे फिंगरप्रिंट (चित्र 3) बनाकर स्थापित किया जा सकता है। जीवों के बीच विकासवादी संबंध स्थापित करने के लिए, उसी विधि को लागू किया जा सकता है, थोड़ा संशोधित किया जा सकता है।

मेडिकल जांच

पीसीआर महत्वपूर्ण रूप से गतिशील और वंशानुगत और वायरल बीमारियों के निदान को सुविधाजनक बनाने के लिए संभव बनाता है। वांछित जीन को उपयुक्त प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर द्वारा बढ़ाया गया है, और फिर उत्परिवर्तन निर्धारित करने के लिए अनुक्रमित किया गया है। बीमारी के लक्षणों से हफ्तों या महीनों के लिए, संक्रमण के तुरंत बाद वायरल संक्रमण का पता लगाया जा सकता है।

व्यक्तिगत चिकित्सा

कभी-कभी दवाएं कुछ रोगियों के लिए विषाक्त या एलर्जी हैं। इसके कारण आंशिक रूप से आंशिकता और दवाओं और उनके डेरिवेटिव्स के चयापचय में व्यक्तिगत मतभेदों में हैं। ये मतभेद आनुवंशिक स्तर पर निर्धारित किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, एक रोगी के पास एक विशिष्ट साइटोक्रोम होता है (यकृत प्रोटीन, जो विदेशी पदार्थों के चयापचय के लिए जिम्मेदार है) अधिक सक्रिय हो सकता है, दूसरा कम है। यह निर्धारित करने के लिए कि किस प्रकार के साइटोक्रोम में यह रोगी है, दवा को लागू करने से पहले एक पीसीआर विश्लेषण करने का प्रस्ताव है। इस विश्लेषण को प्रारंभिक जीनोटाइपिंग (ईएनजी) कहा जाता है। भावी जीनोटाइपिंग।).

क्लोनिंग जीन

जीन की क्लोनिंग (जीवों के क्लोनिंग के साथ भ्रमित नहीं होने के लिए नहीं) जीन अलगाव की प्रक्रिया है और, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर हेरफेर के परिणामस्वरूप, इस जीन के उत्पाद की एक बड़ी संख्या का उत्पादन। पीआरआर का उपयोग जीन को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जिसे तब डाला जाता है वेक्टर - डीएनए का टुकड़ा, एक ही या अलग में विदेशी जीन ले जाने, खेती, जीव के लिए सुविधाजनक। वैक्टर के रूप में, उदाहरण के लिए, प्लास्मिड्स या वायरल डीएनए का उपयोग किया जाता है। एक विदेशी जीव को जीन डालने का उपयोग आमतौर पर इस जीन - आरएनए या अक्सर, प्रोटीन के उत्पाद को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। इस प्रकार, औद्योगिक मात्रा में, कृषि, चिकित्सा इत्यादि में उपयोग के लिए कई प्रोटीन प्राप्त किए जाते हैं।

अंजीर। चार: प्लाज्मिड का उपयोग कर क्लोनिंग जीन।
(1) जीव का गुणसूत्र डीएनए ए (2) पीसीआर। (3) जीन जीन ए (4) की कई प्रतियां प्लाज्मिड में एक जीन डालती हैं। (5) जीव के जीनोम के साथ प्लाज्मिड ए (6) बॉडी वी में प्लास्मिड्स का परिचय वी। (7) शरीर के जीन ए की प्रतियों की संख्या को गुणा करता है।

डीएनए श्रृंखला बनाना

Dideoxinucleotide पीसीआर के फ्लोरोसेंट लेबल या रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग कर अनुक्रमण विधि में एक अभिन्न हिस्सा है, क्योंकि यह डीएनए सर्किट के बहुलककरण के दौरान ठीक है, एक फ्लोरोसेंट या रेडियोधर्मी लेबल के साथ लेबल न्यूक्लियोटाइड के एक डेरिवेटिव्स। संश्लेषित सर्किट में dideoxinucleotide का अनुलग्नक संश्लेषण की चट्टान की ओर जाता है, जिससे आप जेल में अलगाव के बाद विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड की स्थिति निर्धारित कर सकते हैं।

Mutagenez

वर्तमान में, पीसीआर mutagenesis (डीएनए के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में संशोधन) का मुख्य तरीका बन गया है। पीसीआर के उपयोग ने mutagenesis आयोजित करने के लिए प्रक्रिया को सरल बनाने और तेज करने के साथ-साथ इसे अधिक विश्वसनीय और पुनरुत्पादित करने के लिए भी संभव बना दिया।

लेख के अंत में, देखें
पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर, पीसीआर)1 9 83 में कैरी मुलिस का आविष्कार किया (अमेरिकी वैज्ञानिक)। इसके बाद, उन्हें इसके लिए नोबेल पुरस्कार का आविष्कार प्राप्त हुआ। वर्तमान में, पीसीआर डायग्नोस्टिक्स संक्रामक बीमारियों के सबसे सटीक और संवेदनशील नैदानिक \u200b\u200bतरीकों में से एक है।
पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) - आणविक जीवविज्ञान की प्रायोगिक विधि, जैविक सामग्री (नमूना) में कुछ न्यूक्लिक एसिड टुकड़ों (डीएनए) की कम सांद्रता में उल्लेखनीय वृद्धि के लिए एक विधि।
पीसीआर विधि कृत्रिम स्थितियों (विट्रो में) में एंजाइमों का उपयोग करके डीएनए के एक निश्चित भाग के कई दोगुनी पर आधारित है। नतीजतन, दृश्य पहचान के लिए पर्याप्त डीएनए की मात्रा विकसित की जा रही है। साथ ही, केवल साइट कॉपी की जाती है, जो निर्दिष्ट शर्तों को पूरा करती है, और केवल तभी यदि यह अध्ययन के तहत नमूने में मौजूद है।
डीएनए प्रतियों की संख्या में सरल वृद्धि के अलावा (इस प्रक्रिया को प्रवर्धन कहा जाता है), पीसीआर आनुवांशिक सामग्री (उत्परिवर्तन की शुरूआत, डीएनए टुकड़ों के विभाजन) के साथ कई अन्य कुशलताओं की अनुमति देता है, और इसका व्यापक रूप से जैविक और चिकित्सा अभ्यास में उपयोग किया जाता है उदाहरण के लिए, रोगों को स्थापित करने के लिए, पितृत्व स्थापित करने के लिए, जीनों को क्लोन करने, उत्परिवर्तन की शुरूआत, नए जीन आवंटित करने के लिए।

विशिष्टता और आवेदन

पीसीआर

पीसीआर के लिए सबसे सरल मामले में, निम्नलिखित घटकों की आवश्यकता है:

• डीएनए मैट्रिक्स में डीएनए के उस हिस्से को शामिल करने के लिए आवश्यक है;
• दो प्राइमर वांछित टुकड़े के सिरों के पूरक हैं;
• थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेज़;
• deoxinucleotidtriphosphates (ए, जी, सी, टी);
• एमजी 2 + आयनों पॉलिमरस के संचालन के लिए आवश्यक हैं;
• उभयरोधी घोल।

पीसीआर एक एम्पलीफायर में किया जाता है - एक उपकरण आवधिक शीतलन और हीटिंग ट्यूब प्रदान करता है, आमतौर पर कम से कम 0.1 डिग्री सेल्सियस की सटीकता के साथ। प्रतिक्रिया मिश्रण की वाष्पीकरण से बचने के लिए, उच्च उबलते तेल ट्यूब में जोड़ा जाता है, उदाहरण के लिए, vaseline। विशिष्ट एंजाइम जोड़ने से पीसीआर प्रतिक्रिया की उपज में वृद्धि हो सकती है।
रिएक्शन कोर्स

आम तौर पर, पीसीआर का संचालन करते समय, 20 - 35 चक्र किए जाते हैं, जिनमें से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं। दो-फंसे डीएनए मैट्रिक्स को 94 - 9 6 डिग्री सेल्सियस (या 98 डिग्री सेल्सियस तक, यदि एक विशेष थर्मोस्टेबल पॉलिमरस का उपयोग किया जाता है) 0.5 - 2 मिनट तक किया जाता है ताकि डीएनए श्रृंखलाएं अलग हो गईं। इस चरण को denaturation कहा जाता है - दो श्रृंखलाओं के बीच हाइड्रोजन बंधन नष्ट हो जाते हैं। कभी-कभी पहले चक्र से पहले, मैट्रिक्स और प्राइमरों के पूर्ण denaturation के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण का प्रारंभिक हीटिंग 2 से 5 मिनट के लिए किया जाता है।
जब सर्किट अलग हो जाते थे, तो तापमान कम हो जाता है ताकि प्राइमर एकल-फंसे हुए मैट्रिक्स से संपर्क कर सकें। इस चरण को एनीलिंग कहा जाता है। एनीलिंग तापमान प्राइमरों पर निर्भर करता है और आमतौर पर उनके पिघलने बिंदु से 4 - 5 डिग्री सेल्सियस द्वारा चुना जाता है। स्टेज टाइम - 0.5 - 2 मिनट।

डीएनए पॉलीमेरस एक बीज के रूप में प्राइमर का उपयोग कर मैट्रिक्स सर्किट की प्रतिलिपि बनाता है। यह लम्बाई का चरण है। लम्बाई का तापमान बहुलक पर निर्भर करता है। अक्सर उपयोग किए जाने वाले बहुलक 72 डिग्री सेल्सियस पर सबसे अधिक सक्रिय होते हैं। लम्बाई का समय पॉलिमरस डीएनए के प्रकार और प्रवर्धित टुकड़ा की लंबाई दोनों पर निर्भर करता है। आम तौर पर, लम्बाई का समय प्रत्येक हजार बेस जोड़े के लिए एक मिनट के बराबर होता है। सभी चक्रों के अंत के बाद, अंतिम लम्बाई का एक अतिरिक्त चरण अक्सर सभी एकल-श्रृंखला के टुकड़ों को पूरा करने के लिए किया जाता है। यह चरण 10 - 15 मिनट तक रहता है।
प्रयोगशाला में अनुसंधान और परिवहन के लिए सामग्री की तैयारी

एक सफल विश्लेषण के लिए, रोगी में सामग्री एकत्र करना और इसे ठीक से तैयार करना महत्वपूर्ण है। यह जाना जाता है कि प्रयोगशाला निदान नमूना तैयारी के चरण में अधिकांश त्रुटियां (70% तक) की जाती हैं। Invitro प्रयोगशाला में रक्त लेने के लिए, वैक्यूम सिस्टम वर्तमान में लागू होते हैं, जो एक तरफ मरीज को कम से कम घायल कर दिया जाता है, और दूसरी तरफ, यह आपको सामग्री को इस तरह से लेने की अनुमति देता है कि यह किसी भी कर्मियों से संपर्क नहीं करता है या उसके साथ पर्यावरण। यह सामग्री के प्रदूषण (प्रदूषण) से बचाता है और पीसीआर विश्लेषण की निष्पक्षता प्रदान करता है।

डीएनए - deoxyribonucleic एसिड - जैविक बहुलक, दो प्रकार के न्यूक्लिक एसिड जो भंडारण, पीढ़ी से पीढ़ी और जीवित जीवों के विकास और संचालन के लिए आनुवंशिक कार्यक्रम के कार्यान्वयन प्रदान करते हैं। कोशिकाओं में डीएनए की मुख्य भूमिका आरएनए और प्रोटीन की संरचना पर जानकारी का दीर्घकालिक भंडारण है।

आरएनसी-रिबोन्यूक्लिक एसिड एक जैविक बहुलक है जो इसकी रासायनिक संरचना के करीब डीएनए है। आरएनए अणु एक ही मोनोमेरिक लिंक से बनाया गया है - डीएनए के रूप में न्यूक्लियोटाइड। एक नियम के रूप में आरएनए की प्रकृति में, एक श्रृंखला के रूप में मौजूद है। कुछ आरएनए वायरस आनुवांशिक जानकारी का एक वाहक हैं। सेल डीएनए से प्रोटीन तक जानकारी के हस्तांतरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आरएनए को डीएनए मैट्रिक्स पर संश्लेषित किया जाता है। इस प्रक्रिया को प्रतिलेखन कहा जाता है। डीएनए के पास ऐसे अनुभाग हैं जहां किए गए कार्यों में भिन्न तीन आरएनए प्रजातियों के संश्लेषण के लिए जानकारी जिम्मेदार है: सूचना या मैट्रिक्स आरएनए (एमआरएनए), रिबोसोमल (आरआरएनए) और परिवहन (टीआरएनए)। सभी तीन प्रकार के आरएनए एक तरफ या दूसरे में प्रोटीन के संश्लेषण में शामिल हैं। हालांकि, प्रोटीन संश्लेषण पर जानकारी केवल एमआरएनए में निहित है।

न्यूक्लियोटाइड न्यूक्लिक एसिड अणुओं में मुख्य दोहराव इकाई हैं, नाइट्रोजन बेस के रासायनिक यौगिक का उत्पाद, पांच कार्बन चीनी (पेंटोस) और एक या अधिक फॉस्फेट समूह। न्यूक्लिक एसिड में प्रस्तुत न्यूक्लियोटाइड में एक फॉस्फेट समूह होता है। उन्हें उनमें निहित नाइट्रोजन आधार कहा जाता है - एडेनिन (ए) जिसमें एडेनाइन, गुआनिन (जी) - गुआनाइन, साइटोसाइन (सी) - साइटोसिन, थाइमिनिक (टी) - टिमिन, यूराकाइल (यू) - यूरासिल। डीएनए में 4 प्रकार के न्यूक्लियोटाइड्स - ए, टी, जी, सी, आरएनए की संरचना भी 4 प्रकार है - ए, यू, जी, सी। सभी डीएनए न्यूक्लियोटाइड में चीनी deoxyribosis, आरएनए - रिबोज़ है। न्यूक्लियोटाइड न्यूक्लिक एसिड के गठन में, बाध्यकारी, अणु के एक शेरो-फॉस्फेट ऑसीलेशन का निर्माण, जिसमें एक तरफ आधार हैं।

प्राइमर अटूट डीएनए है जो मैट्रिक्स श्रृंखला को दोहराने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रत्येक प्राइमर्स एक दो श्रृंखला मैट्रिक्स की श्रृंखला में से एक की तुलना में पूरक हैं, जो प्रवर्धित क्षेत्र की शुरुआत और अंत को तैयार करते हैं।

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महत्वपूर्ण!

इस खंड से जानकारी का उपयोग आत्म-निदान और आत्म-उपचार के लिए नहीं किया जा सकता है। बीमारी के दर्द या अन्य उत्तेजना के मामले में, नैदानिक \u200b\u200bअध्ययन केवल उपस्थित चिकित्सक नियुक्त करना चाहिए। उपचार की निदान और उचित नियुक्ति करने के लिए, आपको अपने उपस्थित चिकित्सक से संपर्क करना चाहिए।